甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1抑制劑M22對癲癇小鼠認(rèn)知障礙的改善作用研究

林力峰，梁 維，劉 洲，冼文川，鐘望濤

癲癇是由于腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電而引起的慢性、反復(fù)發(fā)作的短暫性大腦興奮-抑制功能失調(diào)綜合征。其主要的臨床特性是發(fā)作性、重復(fù)性、刻板性與短暫性[1-3]；有文獻(xiàn)[4]報道30%～40%的癲癇患者均伴有不同程度的認(rèn)知障礙。目前的抗癲癇藥物均不能明顯改善癲癇患者的認(rèn)知功能損傷與多動障礙，有些藥物甚至能夠加重患者的認(rèn)知損傷，并且加重多動障礙的發(fā)生[5-6]。

甘氨酸作為腦內(nèi)最為重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)進(jìn)而聯(lián)合作用于谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞。研究[7-8]表明NMDA受體的激活，對于學(xué)習(xí)記憶能力的維持以及長時程增強(qiáng)起著重要的作用。研究[9-10]表明，突觸間隙的甘氨酸水平又受突觸前膜的甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glycine transporter 1，GlyT1)調(diào)節(jié)，GlyT1抑制劑又可以提高NMDA受體周圍甘氨酸的濃度。因此可以間接通過抑制甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性來激活NMDA受體，增強(qiáng)NMDA受體的活性。有研究[11]顯示在癲癇模型中GlyT1抑制劑2,4-dichloro-N-{[4-(cyclopropylmethyl)-1-(ethylsulfonyl) piperidin-4-yl] methyl}benzamide (M22)具有明顯的抗驚厥作用，并對于癲癇發(fā)作具有一定的治療作用。該文主要探究GlyT1抑制劑M22對于癲癇小鼠的認(rèn)知功能障礙的改善作用及其主要作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑M22購自深圳MedChemExpress公司；甘氨酸購自上海威奧生物科技有限公司;實驗所需的一抗、二抗與戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)均購自美國Sigma公司。

1.2動物實驗動物為清潔級C57BL/6雄性小鼠50只(動物購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院)，體質(zhì)量25～30 g。動物飼養(yǎng)和實驗場所為廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心和廣東醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所。小鼠的整體飼養(yǎng)在通風(fēng)良好，光照周期為12 h晝夜交替，環(huán)境溫度(25±1) ℃，濕度為(50±10)%的恒定環(huán)境，并可以自由飲水?dāng)z食。動物實驗的所有操作在每天9:00～17:00 期間進(jìn)行。所有動物實驗完全符合廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的動物倫理學(xué)條例。

1.3癲癇模型的建立與動物分組在分組前，對實驗動物進(jìn)行4 d 的水迷宮訓(xùn)練，剔除存在學(xué)習(xí)記憶障礙的小鼠。然后將50只C57BL/6小鼠按照質(zhì)量隨機(jī)分為3組，分別是空白對照組(Control,n=10)，模型組(Model,n=20)，M22組(M22,n=20)?？瞻讓φ战M小鼠腹腔注射等量的生理鹽水，模型組和M22組小鼠則是經(jīng)過腹腔注射PTZ (30 mg/kg) 制備慢性點(diǎn)燃癲癇模型，連續(xù)腹腔注射PTZ 2周時間，并同時通過灌胃給予M22組小鼠 40 mg/(kg·d)的M22[按照0.1%(w/v)的比例將M22均勻分散在羧甲基纖維素中]。參照癲癇發(fā)作Racine分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：無任何反應(yīng)或表現(xiàn)出興奮癥狀；Ⅰ級：面部肌肉陣攣，包括動須、節(jié)奏性咀嚼、眨眼；Ⅱ級：伴隨Ⅰ級癥狀，并新添加節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級：伴隨Ⅱ級癥狀，并新添加肌陣攣、伴隨身體直立；Ⅳ級：伴隨Ⅲ級癥狀，并新添加后肢站立，有強(qiáng)直陣攣發(fā)作；Ⅴ級：伴隨Ⅳ級癥狀，并新添加失去體位控制、跌倒。在癲癇模型點(diǎn)燃過程中觀察其癲癇發(fā)作情況；當(dāng)達(dá)到Ⅲ級并持續(xù)3 d以上時，則被認(rèn)為癲癇模型已經(jīng)完全點(diǎn)燃。

1.4認(rèn)知功能檢測利用水迷宮實驗測試小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，當(dāng)連續(xù)給藥14 d后開始利用Morris水迷宮實驗進(jìn)行檢測。Morris水迷宮實驗水溫控制在(20±0.5) ℃，加入二氧化鈦使得池水變?yōu)椴煌该鞯陌咨哉谏w實驗小鼠在水中的嗅覺和視覺。Morris水迷宮由一個圓柱型水池(直徑：80 cm；高：70 cm)和可移動站臺組成(直徑：8 cm)。實驗時使得水面高于平臺1cm。連續(xù)進(jìn)行4 d訓(xùn)練，每天開始時，將小鼠從任意一個象限面向池壁放入水中，每次讓小鼠游泳60 s來尋找隱藏的站臺。如果成功地找到站臺，則讓小鼠在站臺上停留15 s；如果60 s內(nèi)未能成功找到站臺，則將小鼠牽引到站臺上同樣停留15 s。第5天則進(jìn)行測試，去掉平臺并記錄小鼠在60 s內(nèi)在目標(biāo)象限的運(yùn)動總路程、目標(biāo)象限停留時間等指標(biāo)。

1.5海馬HE染色觀察行為學(xué)測試以后，立即將小鼠處死，迅速取腦組織并采用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋，制成厚3 μm 的切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE) 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6凋亡相關(guān)蛋白測定采用Westem blot法測定Bcl-2、Bax和細(xì)胞色素C(Cytochrome C，CytC)等凋亡相關(guān)蛋白的含量表達(dá)。低溫條件下取大鼠皮層腦組織，稱重后液氮勻漿。4 ℃條件裂解30 min，4 ℃、12 000 r /min離心10 min，取上清液；采用BCA法測定皮層組織的蛋白含量。采用SDS 聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；冰浴條件下轉(zhuǎn)膜2 h; 采用TBST 反復(fù)漂洗3 次；置于平緩搖床內(nèi)，37 ℃條件下封閉孵育1 h；再用TBST 漂洗3 次加入Ⅰ抗后4 ℃孵育過夜；采用TBST 漂洗3 次后；加入熒光Ⅱ抗置于37 ℃平緩搖動孵育1 h；再一次TBST 反復(fù)漂洗3 次。然后進(jìn)行凝膠圖像，并對數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析。

1.7腦皮質(zhì)GFAP和FGF-2蛋白表達(dá)的測定Westem blot法檢測腦組織的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)的蛋白表達(dá)量。具體步驟如上所述。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1水迷宮實驗結(jié)果Model組較Control組潛伏期顯著延長(P<0.05)，表明癲癇發(fā)作造成了實驗小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能發(fā)生障礙；當(dāng)給予M22后，M22組與Model組相比潛伏期顯著降低(P<0.05)，明顯恢復(fù)到Control組水平，表明M22對于癲癇導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙有顯著的改善作用。此外，Model組與Control組相比，穿越站臺次數(shù)與目標(biāo)象限活動時間都明顯縮短(P<0.05)，當(dāng)給予M22后M22組較Model組的穿越站臺次數(shù)與目標(biāo)象限活動路程均明顯恢復(fù)到Control組水平。見圖1。

2.2海馬HE染色觀察海馬組織HE染色結(jié)果：Control組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，邊緣清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰并呈現(xiàn)圓形，染色質(zhì)分布均勻；Model組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞則出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)模型不清，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不完整，海馬神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的凋亡，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核輪廓消失；當(dāng)給予M22后，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞則出現(xiàn)恢復(fù)到Control組的水平，表明M22具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠抑制神經(jīng)元的凋亡，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受損傷。見圖2。

2.3大腦皮層凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的測定通過Western blot檢測小鼠大腦皮層凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量，見圖3。Model組小鼠大腦皮層的Bcl-2/Bax的比值較Control組顯著降低，當(dāng)給予M22后，癲癇小鼠的Bcl-2/Bax的比值顯著升高；此外，Model組小鼠大腦皮層的CytC蛋白表達(dá)量較Control組顯著升高，當(dāng)給予M22后，癲癇小鼠的CytC蛋白表達(dá)量顯著降低；以上結(jié)果均表明癲癇會加速神經(jīng)元凋亡，而M22具有神經(jīng)保護(hù)作用。

2.4大腦皮層GFAP和FGF-2蛋白表達(dá)量的測定GFAP和FGF-2蛋白的表達(dá)見圖4：Model組小鼠大腦皮層的GFAP蛋白含量較Control組顯著升高；當(dāng)給予M22時，小鼠大腦皮層的GFAP蛋白含量顯著回調(diào)。此外，Model組小鼠大腦皮層的FGF-2蛋白含量較Control組顯著降低；當(dāng)給予M22時，小鼠大腦皮層的FGF-2蛋白含量顯著升高。

3 討論

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，病因復(fù)雜；但是反復(fù)的癲癇發(fā)作可導(dǎo)致大腦功能損傷，尤其易導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。在癲癇患者中，認(rèn)知功能損傷的發(fā)生率大約在30%～40%。此外，在癲癇疾病相關(guān)研究中，PTZ可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生和人類癲癇患者相似的行為學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)改變，且PTZ并不具有神經(jīng)毒性作用，因此被廣泛用于抗癲癇藥物研究及其相關(guān)發(fā)病機(jī)制研究[3]。

圖1 水迷宮實驗結(jié)果A:穿越站臺次數(shù);B：逃跑潛伏期；C：目標(biāo)象限活動時間；與Control組比較：*P<0.05

圖2 海馬組織HE染色 ×50

圖3 小鼠大腦皮層凋亡相關(guān)蛋白的測定與Control組比較：*P<0.05

圖4 大腦皮質(zhì)GFAP和FGF-2蛋白表達(dá)的測定與Control組比較：*P<0.05

目前，在動物學(xué)習(xí)記憶能力評價中常用的實驗是Morris水迷宮實驗[12]，因此本文在評價PTZ誘導(dǎo)的癲癇小鼠的認(rèn)知功能是采用Morris水迷宮實驗進(jìn)行評價，結(jié)果表明PTZ導(dǎo)致的癲癇小鼠的潛伏期較Control組顯著增加，而穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間均顯著降低，表明PTZ導(dǎo)致的癲癇小鼠的認(rèn)知功能顯著降低。當(dāng)給予PTZ導(dǎo)致的癲癇小鼠M22后，其Morris水迷宮實驗相關(guān)評價指標(biāo)顯著回調(diào)到Control組水平，表明M22對于PTZ導(dǎo)致的癲癇小鼠的認(rèn)知功能障礙具有顯著的改善作用。

研究[13]表明癲癇發(fā)作后，可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡、壞死；而海馬神經(jīng)元與學(xué)習(xí)認(rèn)知功能具有顯著的相關(guān)性，海馬神經(jīng)元的損傷可能是其發(fā)生認(rèn)知功能障礙的主要原因。因此，本文對其海馬組織進(jìn)行HE染色觀察，結(jié)果顯示Model組小鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，當(dāng)給予M22后，其神經(jīng)元壞死減少，表明M22具有神經(jīng)保護(hù)作用。為了進(jìn)一步評價神經(jīng)元的凋亡情況，對其大腦皮層的相關(guān)凋亡蛋白進(jìn)行測定，結(jié)果表明Model組小鼠大腦皮層的Bcl-2/Bax的比值較Control組顯著降低，而CytC蛋白表達(dá)量較Control組顯著升高，當(dāng)給予M22后，癲癇小鼠的Bcl-2/Bax的比值與CytC蛋白表達(dá)量均顯著回調(diào)；以上結(jié)果均表明癲癇會加速神經(jīng)元凋亡，而M22具有神經(jīng)保護(hù)作用。

此外，星型膠質(zhì)細(xì)胞對于腦部環(huán)境起著重要的控制作用，對于胞外鉀離子和谷氨酸的堆積有著重要的調(diào)控作用。GFAP是星型膠質(zhì)細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志物。星型膠質(zhì)細(xì)胞激活表明神經(jīng)細(xì)胞受到損傷，因此GFAP經(jīng)常作為評價腦損傷的一個重要指標(biāo)[14]。本研究測定了大鼠皮層組織的GFAP蛋白量的表達(dá)，結(jié)果顯示Model組GFAP蛋白表達(dá)量較Control組顯著升高，當(dāng)給予M22后，其表達(dá)量顯著降低，表明M22具有神經(jīng)保護(hù)作用。此外，F(xiàn)GF-2為一種抑制細(xì)胞凋亡蛋白[15]，在Model組顯著降低，當(dāng)給予M22后顯著回調(diào)，表明M22可抑制細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1抑制劑M22可以改善癲癇小鼠認(rèn)知功能障礙，提高癲癇小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，為癲癇或者難治性癲癇患者提供新的選擇。