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    煙草質(zhì)膜ATPase4基因的克隆、表達載體構(gòu)建及表達分析

    2019-03-05 10:15:16李立芹
    浙江農(nóng)業(yè)學報 2019年2期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)膜磷酸化煙草

    王 靜,彭 雙,胡 圣,卓 維,陳 倩,李立芹,*

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,四川 成都 611130; 2.作物科學國家級實驗教學示范中心,四川 成都 611130)

    質(zhì)膜ATPase是植物細胞膜上非常重要的功能蛋白,被認為是植物細胞代謝和生命活動過程的主宰酶[1]。ATPase在細胞質(zhì)膜上產(chǎn)生質(zhì)子梯度,在植物生長發(fā)育中調(diào)節(jié)著許多生理過程[2]。根據(jù)位置及功能不同,植物細胞內(nèi)的ATPase可分為F、P和V三大類型,其中F型ATPase主要分布在線粒體和葉綠體上,P型ATPase分布在質(zhì)膜上,V型ATPase分布在液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體、高爾基體膜上[3]。ATPase在植物生長發(fā)育的各個時期以及脅迫響應(yīng)等多種生理過程中行使重要功能[4]。近年來,關(guān)于植物ATPase基因的鑒定和功能研究取得了較大進展,ATPase由大約10個基因的家族編碼[5]。Ayala等[6]研究表明,鹽角草在200 mmol·L-1NaCl處理下,質(zhì)膜ATPase活性增加。Binzel[7]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下,番茄質(zhì)膜ATPase蛋白表達量增加。也有研究表明,鹽芥幼苗根、葉質(zhì)膜ATPase活性在100~400 mmol·L-1NaCl處理下較對照均有不同程度的提高[8]。構(gòu)樹幼苗在100 μmol·L-1NaCl處理下,質(zhì)膜ATPase活性達到最大值,在150 μmol·L-1NaCl處理下質(zhì)膜ATPase活性有所降低,但均高于對照[9]。

    煙草是我國非常重要的經(jīng)濟作物之一,而冷害、干旱、鹽堿等非生物環(huán)境脅迫嚴重阻礙了煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)[10]。植物細胞中,質(zhì)膜ATPase在細胞生長發(fā)育以及抗逆境脅迫中起著重要的作用[11]。越來越多的質(zhì)膜ATPase基因被克隆,但煙草中編碼質(zhì)膜ATPase4蛋白的基因尚未報道。為此,本實驗從煙草中克隆一個質(zhì)膜ATPase4基因,運用生物信息學方法,預(yù)測ATPase4基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,同時運用qRT-PCR技術(shù),分析該基因在煙草根、莖、葉、花等不同組織中的表達水平以及在低鉀、PEG、高鹽、冷脅迫等逆境下的表達模式,并成功構(gòu)建ATPase4-pcambia1300過表達載體,以期為進一步研究煙草ATPase4基因的功能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及試劑

    本實驗使用的普通煙草品種為K326。大腸埃希菌感受態(tài)DH5α購自VazymeBiotech公司,Trizol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真R045A酶、SYBR Green Master mix、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購自TaKaRa,引物合成與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 材料處理

    挑選籽粒飽滿、大小一致的煙草種子用75%乙醇消毒1 min,然后20%次氯酸鈉溶液消毒20 min,用無菌水反復(fù)清洗5~6次,在超凈工作臺內(nèi)播種于MS培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基上播種3排30粒左右,放置在16 h/8 h(光/暗),25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后,挑取長勢一致的幼苗,在MS培養(yǎng)基上分別加入KCl(10 mmol·L-1)和5% PEG-6000、NaCl(200 mmol·L-1)進行低鉀、干旱、高鹽處理,同時將培養(yǎng)基放入4 ℃培養(yǎng)箱進行低溫處理。處理0、3、6、12、24 h進行整株取樣。

    1.2.2 煙草ATPase4基因的克隆

    參考GenBank收錄的絨毛狀煙草ATPase4序列(序列號:XM_016657566.1),采用同源克隆的方法,用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物全長引物ATPase4-F和ATPase4-R(表1)。擴增反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸3 min;35個循環(huán)。目的片段純化后與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)。隨后在涂有卡那霉素LB平板上進行篩選,菌落PCR檢測篩選陽性克隆,送至上海生物工程有限公司進行測序。

    1.2.3 煙草ATPase4基因的表達分析

    根據(jù)基因序列,采用Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量(qRT-PCR)引物,以煙草18S rRNA為內(nèi)參,引物序列為18S-F和18S-R(表1)。所有的樣品都設(shè)置4個重復(fù),反應(yīng)結(jié)束后,基因相對表達水平用2-△△Ct方法進行計算。

    1.2.4 構(gòu)建過表達載體

    重組克隆載體ATPase4-pMD19-T與表達載體pcambia1300用內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ進行酶切,酶切體系10 μL,含1 μL 10×T緩沖液,1 μL BSA,1 μLXbaⅠ,1 μLSmaⅠ,4 μLNtHA-pMD19-T/pcambia1300載體,2 μL ddH2O?;厥占兓康钠魏笈cpcambia1300載體于16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài),隨后在涂有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進行篩選,菌落PCR檢測篩選陽性克隆,搖菌提取質(zhì)粒,酶切檢測后送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

    1.2.5 煙草ATPase4基因生物信息學分析

    利用ExPASyProtParamtoo分析ATPase4編碼蛋白的理化性質(zhì);DNAMAN軟件分析其編碼蛋白的疏水性;運用IBCP的在線工具SOPMA預(yù)測ATPase4二級結(jié)構(gòu);SWISS-MODEL在線預(yù)測ATPase4的三級結(jié)構(gòu);SMART在線分析ATPase4基因編碼蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)域;NetPhos3.1 Server對蛋白進行磷酸化位點分析;PSORT預(yù)測ATPase4的亞細胞定位;Signal-P4.1 Server在線預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽;運用MEGA 7軟件,采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基因克隆

    提取煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增,瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,在接近3 000 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與載體pMD19-T進行連接,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)。將鑒定出的陽性克隆隨機挑選3個進行測序,結(jié)果顯示,3個測序結(jié)果一致且目的片段大小為2 982 bp。

    2.2 ATPase4-pcambia1300過表達載體的檢測

    表1引物序列

    Table1Primer sequences

    引物名稱引物序列Primer namePrimer sequencesATPase4-FATPase4-RATPase4-qFATPase4-qR18SF18SR5′-ATGGCGGATCAGAAGGGAAC-3′5′-CTAAACCGTGTAATGTTGCT-3′5′-AGGATTCGTGGTATTGGTTGGG-3′5′-CTCTTGGCCTGTTCGGCTATTT-3′5′-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3′5′-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3′

    M,Marker 5 000 bp;1,ATPase4基因。M, Marker 5 000 bp; 1, ATPase4 gene.圖1 ATPase4的克隆Fig.1 Cloning of ATPase4

    將克隆載體ATPase4-pMD19-T與表達載體pcambia1300分別進行酶切,連接轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài),挑選單菌落進行菌落PCR,篩選構(gòu)建成功的陽性克隆。利用菌落PCR篩選陽性克隆,1~8為陽性克隆,9為陰性對照(圖2),陽性克隆在3 000 bp處有清晰的條帶,而陰性對照沒有該條帶。挑取構(gòu)建成功的陽性克隆,送上海生物有限公司進行測序,測序該目的條帶結(jié)果大小為2 982 bp,證明ATPase4-pcambia1300載體構(gòu)建成功。

    2.3 ATPase4基因和蛋白序列分析

    2.3.1 ATPase4的理化性質(zhì)及疏水性分析

    ATPase4編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明:含有20種氨基酸,丙氨酸Ala(94,9.8%)、精氨酸(94,9.8%)含量最高,而半胱氨酸Cys(7,0.7%)含量最少。蛋白預(yù)測的分子質(zhì)量為105.88 ku,含有963個核酸殘基,理論等電點pI為6.66,不穩(wěn)定系數(shù)是34.76,該蛋白是一個穩(wěn)定的蛋白。運用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)進行的疏水性分析結(jié)果顯示,該蛋白總的親水性平均指數(shù)為0.136,該蛋白屬于疏水性蛋白(圖3)。

    M,Marker 5 000 bp;1~8,ATPase4基因;9,陰性對照。M, Marker 5 000 bp; 1-8, ATPase4 gene PCR product; 9, Negative control.圖2 ATPase4過表達載體構(gòu)建Fig.2 Construction of ATPase4 overexpression vector

    2.3.2 ATPase4的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

    如圖4所示,利用IBCP(https://npsa-prabi.ibcp.fr)在線工具對ATPase4基因編碼蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該蛋白中41.12%的氨基酸參與α-螺旋(alpha helix),21.91%的氨基酸參與延伸鏈(extended strand),28.56%氨基酸參與無規(guī)則卷曲(random coil),有8.41%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(beta turn)。所以,該蛋白二級結(jié)構(gòu)的最大元件為α-螺旋(alpha helix)。運用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對ATPase4的三級結(jié)構(gòu)進行分析,用RasTop軟件進行顯示,并將結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)分析進行對比,兩者結(jié)果一致。

    圖3 ATPase4疏水區(qū)預(yù)測Fig.3 Prediction of hydrophobic region of ATPase4

    A,二級結(jié)構(gòu);B,三級結(jié)構(gòu)。A, Secondary structure; B, Tertiary structure.圖4 ATPase4的結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the structure of ATPase4

    2.3.3ATPase4基因編碼蛋白亞細胞定位及信號肽分析

    利用PSORT(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測的ATPase4亞細胞定位;Signal-P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白信號肽。結(jié)果表明,該基因在質(zhì)膜上占0.800,在高爾基體膜占0.400,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上占0.300,在微體(過氧化物酶體)中占0.300,因此,預(yù)測該基因可能定位在質(zhì)膜上。根據(jù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法或隱馬氏模型方法預(yù)測信號肽位置及切割位點,利用mean-score來判斷是否為分泌蛋白(圖5),預(yù)測結(jié)果顯示score值為0.093,小于0.5,說明該基因編碼的蛋白不是分泌蛋白,所以不存在信號肽。

    2.3.4 ATPase4編碼蛋白磷酸化位點分析

    利用NetPhos3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行分析蛋白磷酸化位點,NetPhos3.1是利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測真核細胞蛋白質(zhì)中絲氨酸(Serine)、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點工具,NetPhos中的內(nèi)設(shè)閾值為0.5,高于0.5則被認為是可能的磷酸化位點。NetPhos對ATPase4基因編碼蛋白進行磷酸化位點分析顯示(圖6),ATPase4基因編碼蛋白中含有36個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、23個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點、6個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點,說明該基因編碼的蛋白能被激酶所磷酸化,進而參與逆境脅迫。

    圖5 ATPase4的信號肽預(yù)測Fig.5 Prediction of signal peptide of ATPase4

    圖6 ATPase4的磷酸化位點預(yù)測Fig.6 Prediction of phosphorylation site of ATPase4

    2.3.5 ATPase4同源性分析

    將ATPase4氨基酸序列進行Blastp序列比對,為進一步分析ATPase4蛋白與其他物種內(nèi)質(zhì)膜ATPase家族的蛋白相關(guān)性,將ATPase4氨基酸序列與其他物種進行比對(圖7),結(jié)果顯示,該煙草質(zhì)膜ATPase4蛋白與其他物種質(zhì)膜ATPase4蛋白序列之間具有高度的保守性。采用鄰近法與不同物種做出系統(tǒng)進化樹表明,煙草質(zhì)膜ATPase4氨基酸序列與美花煙草和辣椒質(zhì)膜ATPase4具有較高氨基酸序列相似性,分別為98%、94%;與榴蓮和南瓜質(zhì)膜ATPase4相似性較低,分別為82%和81%(圖8),同源分析結(jié)果表明,該蛋白與其他物種的質(zhì)膜ATPase4相似。

    2.4 ATPase4的組織表達分析

    提取幼苗K326的根、葉、花成熟期的總RNA,進行去除DNA基因組,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增,通過對ATPase4在各個組織的表達量分析(圖9)的結(jié)果表明,ATPase4基因在根中表達量最高,葉和花中表達量較低。根中表達量約為葉的8.9倍,這說明ATPase4基因主要在煙草K326植株的根中表達。

    2.5 ATPase4在逆境脅迫處理下的表達分析

    分別選取經(jīng)KCl(10 mmol·L-1)、5% PEG-6000、NaCl(200 mmol·L-1)以及4 ℃處理后的煙草K326幼苗,對其ATPase4基因的相對表達量進行分析。結(jié)果表明,在低鉀和鹽處理條件下,ATPase4相對表達量分別在6和12 h達到最大值,分別為對照(0 h)的1.73和5.09倍。ATPase4相對表達量在冷處理下受到抑制,是對照表達量(0 h)4 ℃處理24 h的1.99倍。這些結(jié)果表明ATPase4能夠被逆境脅迫相關(guān)的信號分子調(diào)控,其表達量如圖10所示。

    圖7 ATPase4蛋白多重序列比對Fig.7 Multiple sequence alignment of ATPase4

    圖8 ATPase4蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of ATPase4

    不同數(shù)據(jù)間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).圖9 不同組織中ATPase4基因的相對表達量分析Fig.9 Relative expression analysis of ATPase4 in different tissues

    同一處理不同時間點的數(shù)據(jù)間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。Under the same treatment at different time, the bars without the same lowercase letters showed significance at the level of 0.05.圖10 ATPase4在逆境脅迫下的表達分析Fig.10 Relative expression analysis of ATPase4 under abiotic stress

    3 討論

    本實驗采用同源克隆的方法,從普通煙草K326中克隆的一個質(zhì)膜ATPase家族成員ATPase4基因。生物信息學分析表示,ATPase4基因編碼的蛋白具有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點,可能與其調(diào)節(jié)的較多功能相適應(yīng)。質(zhì)膜ATPase分布在質(zhì)膜上,是以兩個催化亞基的形式存在的,是由一個多基因家族編碼的酶類,使這些家族不同的成員具有組織和器官的特異性[12]。質(zhì)膜ATPase在進化上可以大致分為5個亞家族,而煙草ATPase基因表達模式分析證明為第Ⅱ家族,這種表達模式幾乎在任何組織中都有表達[11,13]。熒光定量PCR結(jié)果表明,ATPase4基因在根、葉、花中都有表達,因此推測該基因可能參與了煙草生長的一系列生理反應(yīng)。劉健健等[14]研究表明,質(zhì)膜ATPase家族基因在番茄所有組織中都有表達,但在果實中表達較少。ATPase4基因在根中表達量最高,而在葉和花中表達量較低,與番茄質(zhì)膜ATPase4基因在根中表達量最高相一致[15]。為保證植株正常生長,需從根部吸收更多水分和離子,通過細胞液中積累無機離子或合成有機溶質(zhì)等方式進行滲透調(diào)節(jié)以減輕或避免傷害[16],推測ATPase4基因在煙草和番茄中可能與根中離子運輸有關(guān)。

    在轉(zhuǎn)錄水平上,質(zhì)膜ATPase參與了植物生長發(fā)育過程中多種脅迫反應(yīng)[17]。質(zhì)膜ATPase在植物生長、發(fā)育和對外環(huán)境的適應(yīng)過程中的重要作用已有相關(guān)報道,其中,在鹽脅迫過程中質(zhì)膜ATPase的應(yīng)答功能研究較多[11-15]。qRT-PCR分析結(jié)果表明,煙草ATPase4在低鉀處理6 h時達到最大值,之后又下降,因此推測ATPase4基因可能是在低鉀脅迫早期的響應(yīng)基因,能快速響應(yīng)低鉀脅迫,在后期隨著時間的延長其表達受到了抑制,可能是因為植株適應(yīng)了脅迫。在PEG-6000處理下,ATPase4基因表達水平在0~24 h內(nèi)逐漸增加。Li等[18]用6% PEG處理大豆種子,質(zhì)膜ATPase活性隨著處理時間而增強,在12 h活性達到最大,此后到72 h間活性稍許下降,但仍大于對照。Yang等[19]用6% PEG處理大豆種子,與Li等[18]得出結(jié)論一致。說明ATPase4基因與干旱脅迫相關(guān),因此推測在PEG處理后基因表達量上升使質(zhì)膜ATPase活性增強。

    經(jīng)鹽處理,ATPase4基因表達量明顯提高,表達量12 h達到最大,與劉尼歌等[20]得出鹽能誘導(dǎo)煙草質(zhì)膜ATPase基因表達的結(jié)論相一致。Ballesteros等[21]分別用75和150 mmol·L-1NaCl處理向日葵3 d后,提取根的質(zhì)膜微囊,測定質(zhì)膜ATPase的活性,結(jié)果表明,NaCl處理的向日葵根部質(zhì)膜ATPase的活性顯著提高。鹽脅迫條件下,抗鹽品種可能累積較多的mRNA,參與作物的相關(guān)逆境脅迫,進而導(dǎo)致植物的代謝水平發(fā)生相應(yīng)的改變[22-24]。

    冷處理ATPase4基因表達量在早期(3 h)沒有明顯變化,在6 h時約為對照的0.49倍,說明后期冷處理抑制了ATPase4基因表達。簡令成等[24]研究表明,在5 ℃低溫處理番茄幼苗,12 h后幼苗子葉質(zhì)膜ATPase活性顯著降低。植物在適應(yīng)低溫時,膜脂從液態(tài)變?yōu)榘虢Y(jié)晶態(tài),因而影響膜的流動性,使得基因表達受到抑制,進而導(dǎo)致相關(guān)ATP酶活性降低。

    本實驗結(jié)果表明,ATPase4基因在低鉀、干旱、鹽脅迫和冷脅迫下發(fā)揮重要作用,但其編碼的蛋白的具體功能,尚待進一步研究。后續(xù)研究將進一步獲得轉(zhuǎn)基因煙草以及測定轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)生理指標,進一步闡明該基因在逆境脅迫中的作用。

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