馬源蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及毒力基因檢測

崔一龍，石 蕓，楊達漢，尹有勤，薛江東，霍曉偉，馬德慧

(1.內(nèi)蒙古民族大學 動物科學技術學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病防控工程技術研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種廣泛分布于水、空氣、土壤、飼料和各類食物中的革蘭氏陽性、兼性需氧產(chǎn)芽孢桿菌[1]。該菌為條件致病菌[2]，有的雖可作為益生菌添加到食品和飼料中，但有的也會污染食物，引起人畜的惡心嘔吐、發(fā)熱、腹痛腹瀉等癥狀，也是引起牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的常見病原菌[3]，但是對馬感染該菌的報道極其罕見。

2018年年初，內(nèi)蒙古通遼市某馬術俱樂部多匹賽馬頸部及關節(jié)部皮膚接連出現(xiàn)直徑約為3 cm的膿腫結(jié)節(jié)，隨后結(jié)節(jié)逐漸增大，變成膿腫，膿腫破潰后流出淡紅色及黃白色膿液，潰瘍處容易出血且不易愈合，少數(shù)馬匹病死。內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院實驗室通過對患病馬匹膿液及死亡馬匹肝臟中分離到的細菌進行染色鏡檢、動物致病性試驗、生化鑒定、藥物敏感試驗、16S rRNA基因擴增、系統(tǒng)進化樹分析及部分毒力基因檢測分析，確定了該菌為致病性的蠟樣芽孢桿菌?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用碘酊對患病馬匹未破潰的膿包進行消毒，再用消毒棉簽蘸取膿汁保存?zhèn)溆茫?0只20 g左右小白鼠由內(nèi)蒙古民族大學動物實驗室提供。酵母浸粉、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏購自青島海博生物技術有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根公司；DL 1 000 DNA Marker、DL 2 000 DNA Marker、PCR Mastermix、6×DNA Loading Buffer購自TaKaRa公司。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

將無菌采集的膿汁及死亡馬匹的肝臟分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取血瓊脂平板上生長的細菌菌落進行革蘭氏染色和顯微鏡檢查；再挑取細菌菌落接種于普通液體LB培養(yǎng)基中，150 r·min-137 ℃振蕩培養(yǎng)16 h。收集菌體進行后續(xù)實驗。

1.3 分離菌的動物致病性試驗

將小白鼠分為實驗組及對照組，其中實驗組分為3個小組，每組5只小鼠，這3個小組的小鼠分別腹腔注射104、106、108CFU·mL-1的分離菌，每只注射0.5 mL；對照組的5只小鼠分別腹腔注射0.5 mL生理鹽水。注射后每3 h觀察并記錄一次結(jié)果，將死亡小鼠進行剖檢，再次分離致病菌進行鑒定。

1.4 分離菌的生化鑒定和藥物敏感性測試

使用BD PhoenixTM100全自動微生物及藥敏分析系統(tǒng)對菌株進行生化特性鑒定和藥物敏感性測試，吸取25 μL 0.6個麥氏單位的菌液加入到AST肉湯，將肉湯倒入革蘭氏陽性鑒定藥敏復合檢測板，再將檢測板放入儀器中，反應結(jié)束后儀器自動讀卡并顯示結(jié)果。

1.5 分離菌的16S rRNA PCR鑒定

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的DNA作為模板。PCR擴增引物使用16S rRNA基因擴增通用引物，由吉林省庫美生物有限公司合成，上游引物27f序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492r序列為：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR擴增反應的總體系為25 μL∶PCR Mastermix 11 μL，ddH2O 11 μL，DNA模板 2 μL，上下游引物各0.5 μL。反應條件：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 33 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 分離菌株同源性及進化樹分析

16S rRNA PCR產(chǎn)物由北京生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank進行BLAST比對。選取同源性相近的幾條序列，用MEGA 5.0軟件對選取的序列進行編輯，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果。

1.7 分離菌的毒力基因PCR檢測

根據(jù)文獻[4]，設計腸毒素FM基因(entFM)、細胞毒素K基因(cytK)、溶血型腸毒素基因(hbl)、非溶血型腸毒素基因(nhe)等8種潛在毒力基因的引物，引物由吉林省庫美生物有限公司合成，引物信息見表1。PCR反應體系及條件參照1.5節(jié)所述，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株培養(yǎng)特征

病原菌在營養(yǎng)瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)12 h，形成較大、灰白色、不透明、圓形、凸起的菌落，邊緣呈毛玻璃狀，迎光呈白蠟狀；在血瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)12 h形成淺灰色、似毛玻璃狀菌落；革蘭氏染色鏡檢為陽性大桿菌，菌體單個或長鏈狀排列，有橢圓形芽孢，位于菌體中央或近端(圖1)。培養(yǎng)特性初步表明分離菌株為蠟樣芽孢桿菌菌群。

表1毒力基因PCR擴增引物

Table1Virulence gene PCR amplification primers

目的基因Target gene引物名稱Primer name引物序列Primer sequence(5′-3′)產(chǎn)物長度PCR product/bp參考文獻ReferencesentFMentFM FGTTCGTTCAGGTGCTGGTAC486[5]entFM RAGCTGGGCCTGTACGTACTTcytKcytK FCGACGTCACAAGTTGTAACA565[5]cytK RCGTGTGTAAATACCCCAGTTnheAnheA FTACGCTAAGGAGGGGCA500[6]nheA RGTTTTTATTGCTTCATCGGCTnheBnheB FCAAGCTCCAGTTCATGCGG935[6]nheB RGATCCCATTGTGTACCATTGnheCnheC FACATCCTTTTGCAGCAGAAC618[6]nheC RCCACCAGCAATGACCATATChblAhblA FGCAAAATCTATGAATGCCTA884[6]hblA RGCATCTGTTCGTAATGTTTThblChblC FCCTATCAATACTCTCGCAA695[6]hblC RTTTCCTTTGTTATACGCTGChblDhblD FAATCAAGAGCTGTCACGAAT430[6]hblD RCACCAATTGACCATGCTAAT

2.2 分離菌動物致病性試驗結(jié)果

對照組的小鼠在實驗期內(nèi)一直未發(fā)?。辉囼灲M中，注射104CFU·mL-1菌液的小鼠6 h后接連出現(xiàn)食欲減退、被毛粗亂、精神萎靡、全身顫抖的現(xiàn)象，注射106CFU·mL-1菌液的小鼠12 h后全部死亡，而注射108CFU·mL-1菌液的小鼠6 h內(nèi)全部死亡。剖殺死亡的小鼠，從心臟及肝臟中都分離到蠟樣芽孢桿菌，該菌在動物體內(nèi)呈敗血癥感染。動物試驗結(jié)果表明，本研究中分離到的蠟樣芽孢桿菌具有很強的致病性。

圖1 分離菌株在顯微鏡下的形態(tài)(400×)Fig.1 Morphology of the isolates under the microscope(400×)

2.3 分離菌生化鑒定結(jié)果

利用Phoenix TM 100全自動微生物及藥敏分析系統(tǒng)對分離菌株進行檢測，結(jié)果顯示，該菌能分解葡萄糖、果糖、海藻糖等，不分解尿素、塔格糖、七葉酸乙酸等(表2)，表明分離菌符合蠟樣芽孢桿菌的生化特性。

2.4 分離菌藥物敏感性試驗結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示，分離菌株對克林霉素、慶大霉素等藥物敏感，對紅霉素、米諾環(huán)素等藥物中度敏感，對頭孢他啶、氨曲南等藥物耐藥(表3)。藥敏試驗結(jié)果為有針對性地選擇藥物防治蠟樣芽孢桿菌引起的疾病提供了參考。

2.5 分離菌16S rRNA和部分毒力基因PCR鑒定結(jié)果

16S rRNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，獲得目的基因產(chǎn)物與預期目的基因大小相符，測序產(chǎn)物大小為1 402 bp，表明分離菌株為蠟樣芽孢桿菌(圖2)。8種毒力基因PCR擴增再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后均獲得與預期大小相符的產(chǎn)物，毒力基因PCR結(jié)果表明分離菌株具有該8種毒力基因(圖3)。

表2分離菌株生化試驗結(jié)果

Table2Biochemical test results of isolated strains

生化試驗Biochemical tests結(jié)果Results生化試驗Biochemical tests結(jié)果ResultsΒ-龍膽二糖 B-gentiobiose-甲基乙二酸 Methyl oxalic acid+葡萄糖 Dextrose+多粘菌素B Polymyxin B-D-果糖 D-fructose+脫氧核苷 Thymidine+D-葡萄糖酸 D-gluconic acid+4MU-AD-葡萄糖苷 Glucoside-蔗糖 Sucrose-4MU-BD-纖維二糖苷 Fibrous diglycoside+D-甘露醇 D-mannitol+4MU-AD-半乳糖苷 Galactose glucoside-多粘菌素E Polymyxin E+七葉酸乙酸 Heptafolate acetic acid-L-色氨酸-AMC L-tryptophan-AMC-4MU-磷酸鹽 Phosphate+L-焦谷氨酸-AMC L-pyrol-glutamate-AMC-4MU-磷酸鹽(海藻糖) Trehalose+L-脯氨酸-AMC L-proline-AMC-丙氨酸-PNA Alanine-PNA-L-苯丙氨酸-AMC L-phenylalanine-AMC+L-脯氨酸-PNA L-proline-PNA-4MU-N-乙酰-BD-氨基葡糖 Glucosamine-纈氨酸-丙氨酸-PNA Valine-alanine-PNA-ALPHA-酮戊二酸 ALPHA-ketoglutarate+PNP-磷酸鹽 PNP-phosphate-L-亮氨酸-AMC L-leucine-AMC+麥芽三糖 Maltotriose+尿素 Urea-N-乙酰-氨基葡萄糖 N-acetyl-glucosamine+PNP-BD-葡糖苷 PNP-BD-glucoside-D-塔格糖 D-tagatose-亞氨基二乙酸 Iminodiacetic acid+D-海藻糖 D-trehalose+蛋氨酸-AMC Methionine-AMC+麥芽糖 Maltose+甲基戊二酸 Methyl glutaric acid+甲基-α-D-葡萄糖苷 Methyl-α-D-glucoside-

+， 陽性； -, 陰性。

+, Positive; -, Negative.

表3分離菌株藥物敏感性試驗結(jié)果

Table3Drug susceptibility test of the isolates

抗生素Antibiotic結(jié)果Results抗生素Antibiotic結(jié)果Results克林霉素ClindamycinS阿米卡星AmikacinS哌拉西林PiperacillinS四環(huán)素TetracyclineS氯霉素ChloramphenicolS慶大霉素GentamicinS米諾環(huán)素MinocyclineI多粘菌素PolymyxinI紅霉素ErythromycinI頭孢西丁CefoxitinI環(huán)丙沙星CiprofloxacinI萬古霉素VancomycinI氨芐西林AmpicillinR青霉素PenicillinR氨曲南AztreonamR阿莫西林AmoxicillinR新諾明New NominR頭孢噻呋CeftiofurR頭孢唑林CefazolinR頭孢他啶CeftazidimeR

R，耐藥；I，中度耐藥；S，敏感。

R， Drug resistance; I， Moderate resistance; S， Sensitive.

2.5 分離菌株同源性與系統(tǒng)進化樹分析

將分離菌株的測序序列命名為“X”，測序結(jié)果在NCBI的GenBank中進行BLAST比較分析，結(jié)果與序列號為KR999918.1(中國新疆株)的蠟樣芽孢桿菌同源性達到100%。選取比對結(jié)果中同源性相近的序列做系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示，測序序列“X”與序列號為KR999918.1(中國新疆株)的蠟樣芽孢桿菌遺傳距離最近(圖4)，表明該分離菌株為蠟樣芽孢桿菌。

1，16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物；M，DNA marker DL 2 000。1， Product of 16S rRNA by PCR；M， DNA marker DL 2 000.圖2 分離菌株16S rRNA PCR擴增結(jié)果Fig.2 16S rRNA PCR amplification results of isolates

M，DL 1 000 DNA marker；1—8，毒力基因entFM， cytK， nheA， nheB， nheC， hblA， hblC， hblD的擴增結(jié)果。M， DL 1 000 DNA marker; 1-8， Virulence gene of entFM， cytK， nheA， nheB， nheC， hblA， hblC， hblD.圖3 毒力基因PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of virulence genes

圖4 分離菌株16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the isolate 16S rRNA gene

3 討論

本研究對分離得到的菌株進行細菌形態(tài)學觀察、動物致病性試驗、Phoenix TM 100全自動微生物及藥敏分析系統(tǒng)檢測、16S rRNA的分子生物學試驗以及系統(tǒng)進化樹分析等一系列鑒定，證明從患病及死亡馬匹體內(nèi)分離出的致病菌為蠟樣芽孢桿菌。

傳統(tǒng)的細菌鑒別方法步驟繁雜、過程緩慢、大多由人為主觀判斷，易給判定結(jié)果帶來誤差。16S rDNA基因具有高度的保守性和特異性，普遍應用于細菌鑒別或構(gòu)造細菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，是細菌種屬鑒定的分子生物學基礎。本研究中應用的Phoenix TM 100全自動微生物及藥敏分析系統(tǒng)比傳統(tǒng)的生理生化檢驗方法、紙片藥敏法更加專業(yè)和快捷，以更科學的角度對分離菌株進行了明確的鑒定。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株對克林霉素、慶大霉素等多種藥物敏感，應該在國家獸藥使用準則允許的條件下，有針對性地選擇藥物來防治蠟樣芽孢桿菌引起的疾病。

蠟樣芽孢桿菌分布廣泛，與人類的關系也非常緊密。它能產(chǎn)生多種酶類及營養(yǎng)物質(zhì)，增進機體消化吸收，還可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改善生態(tài)環(huán)境等。但是，作為條件致病菌，蠟樣芽孢桿菌還能夠引起人畜食物中毒，造成嘔吐和腹瀉，也是引起牲畜乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的病原菌之一。已有研究表明，蠟樣芽孢桿菌主要含有與腹瀉毒素相關的腸毒素FM基因、細胞毒素K基因、非溶血性腸毒素nhe基因、溶血素bl基因和與嘔吐相關的嘔吐基因[7]，其中腸毒素FM基因控制腸毒素蛋白的合成[8]；細胞毒素K基因?qū)θ祟惸c道上皮細胞具有毒性作用[9]；非溶血性腸毒素可以控制一種金屬蛋白，該蛋白具有分解明膠和膠原的活力[10]；溶血素bl基因具有溶血性、細胞毒性，可引起皮膚潰爛、潰瘍和充血、淤血等癥狀[11]；嘔吐基因可以產(chǎn)生嘔吐毒素，該毒素能保持完整并且轉(zhuǎn)化為活性毒素吸附在內(nèi)臟上[12]。

本研究從分離到的蠟樣芽孢桿菌基因組中檢測到腸毒素FM基因、細胞毒素K基因、非溶血性腸毒素nhe基因和溶血素bl等8種毒力基因。因此可推斷本研究中患病馬匹的膿腫病癥是由溶血素bl基因引起，再加上其他毒素的共同作用導致了部分馬匹的死亡。目前關于蠟樣芽孢桿菌致病性的相關報道少之又少，本研究分離出的蠟樣芽孢桿菌致病性很強，對很多藥物產(chǎn)生了抗藥性，藥敏試驗中耐藥比例占到了常用藥物的40%，給動物造成了極大的危害，這提示人們應該重視致病性蠟樣芽孢桿菌的潛在威脅，加強蠟樣芽孢桿菌用作益生菌時的安全性檢測，以及有必要對病原性蠟樣芽孢桿菌的流行病學進行調(diào)查并對致病性蠟樣芽孢桿菌的毒力基因作進一步的研究。