高效液相色譜法測(cè)定五氯柳胺混懸液的含量及有關(guān)物質(zhì)

白玉彬，張吉麗，朱建民，蘇文杰，董 朕，周緒正，張繼瑜，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050； 2.常州齊暉藥業(yè)有限公司，江蘇 常州 213000)

五氯柳胺(oxyclozanide)是水楊苯酰胺類藥物，化學(xué)名為2，3，5，-三氯-N-(3，5-二氯-2-羥基苯基)-6-羥基苯甲酰胺，其作用機(jī)理主要是抑制寄生蟲體內(nèi)的氧化磷酸化過程，阻止ATP的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致蟲體死亡[1-3]，主要用于治療肝片吸蟲，同時(shí)對(duì)絳蟲和線蟲也具有良好的治療效果[4-9]。2013版英國(guó)藥典[10]和2010版印度藥典[11]均采用吸光度法測(cè)定五氯柳胺混懸液的含量，采用TLC法檢查五氯柳胺混懸液有關(guān)物質(zhì)，我國(guó)還沒有有關(guān)五氯柳胺檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。吸光度法和TLC法的靈敏度、分離度和準(zhǔn)確度等均較低，為嚴(yán)格有效地控制藥品的質(zhì)量，筆者通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-19]，采用HPLC方法，建立了HPLC法測(cè)定五氯柳胺混懸液含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH)，3，5，6-三氯水楊酸(英國(guó)藥典委員會(huì))，2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽(英國(guó)藥典委員會(huì))，磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，五氯柳胺混懸液(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自制)。

1.1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 含量測(cè)定

HPLC條件。色譜柱Hypersil BDS C18(150×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%磷酸水-甲醇(體積比38∶62)；流速為2.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃。取本品適量(約相當(dāng)于五氯柳胺68 mg)，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，離心，精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

專屬性試驗(yàn)。五氯柳胺對(duì)照品溶液：精密稱定五氯柳胺對(duì)照品6.8 mg，置100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解后，再用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。五氯柳胺供試品溶液：取本品適量(約相當(dāng)于五氯柳胺68 mg)，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，離心，精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。輔料干擾溶液：不加五氯柳胺的空白混懸液樣品，按供試品溶液配制方法進(jìn)行配制。3，5，6-三氯水楊酸溶液：精密稱取3，5，6-三氯水楊酸對(duì)照品10.2 mg于20 mL容量瓶中，用2 mL四氫呋喃溶解后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得501 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸溶液。再準(zhǔn)確移取1 mL該溶液于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得。2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液：精密稱取2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽對(duì)照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度(必要時(shí)可超聲溶解)，搖勻，得501 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液。再準(zhǔn)確移取1 mL該溶液于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得。專屬性溶液：精密稱取6.8 mg五氯柳胺對(duì)照品至100 mL容量瓶，用20 mL甲醇溶解后，再分別加入501 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸溶液和501 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液各2 mL，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得。分別將溶劑、輔料干擾溶液、五氯柳胺對(duì)照品溶液、五氯柳胺供試品溶液、3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和專屬性溶液照色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取五氯柳胺適量于100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解樣品后，再用流動(dòng)相定容，搖勻，配制成104.35 μg·mL-1的五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品母液，再將其依次稀釋為85.01、68.01、52.18、34.01 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積y為縱坐標(biāo)，以五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制峰面積(y)-質(zhì)量濃度(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

進(jìn)樣精密度。照專屬性試驗(yàn)中對(duì)照品溶液配制方法，配制五氯柳胺對(duì)照品溶液，照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜峰面積，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。RSD不得大于2.0%。

中間精密度。分別由2個(gè)不同的操作人員使用不同的儀器進(jìn)行測(cè)定。取同一批均勻樣品按照供試品溶液配制方法，配制6份供試品溶液，各取20 μL注入高效液相色譜中，照色譜條件測(cè)定。記錄色譜峰面積，分別計(jì)算RSD。

準(zhǔn)確度。精密稱取五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于容量瓶中，加入處方量空白輔料，按照對(duì)照品溶液配制方法，分別配制成濃度為34、68、104 μg·mL-1的五氯柳胺對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度各3份，按照色譜條件，精密量取20 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)定每個(gè)樣品的實(shí)際濃度，計(jì)算各樣品的回收率、平均回收率及RSD。

溶液穩(wěn)定性。按照供試品溶液配制方法，配制五氯柳胺供試品溶液，分別在0 h和30 h，取20 μL注入液相色譜中，按照色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以五氯柳胺峰面積計(jì)算RSD。

耐用性試驗(yàn)。按照專屬性試驗(yàn)下對(duì)照品溶液及供試品溶液配制方法，分別制備對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別考察流速變化 ± 0.2 mL·min-1、柱溫變化 ± 5 ℃、流動(dòng)相比例變化 ± 2%，以及選用同一品牌不同批號(hào)和填料或規(guī)格類似的不同品牌色譜柱時(shí)儀器的色譜行為變化情況，觀察基線分離情況，計(jì)算各條件下所測(cè)數(shù)據(jù)的平均值及RSD。

樣品含量的測(cè)定。取本品適量(約相當(dāng)于五氯柳胺68 mg)，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，離心；精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，帶入線性回歸方程，求出檢測(cè)的五氯柳胺混懸液樣品的質(zhì)量濃度。

1.2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法

HPLC條件。色譜柱為InertSustainSwift C18(150×4.0 mm，5 μm)；以0.1%磷酸水溶液-甲醇(體積比38∶62)為流動(dòng)相，流速為1.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。

有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法。取本品適量(約相當(dāng)于五氯柳胺102 mg)，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加20 mL甲醇超聲溶解并充分混勻，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法以峰面積計(jì)算，單個(gè)雜質(zhì)不得超過0.5%，雜質(zhì)總量不得超過1.0%，供試品溶液色譜圖中小于對(duì)照溶液主峰面積0.05倍的色譜峰忽略不計(jì)。

專屬性試驗(yàn)。3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液配制方法同1.2.1節(jié)專屬性試驗(yàn)方法。專屬性溶液：精密稱量五氯柳胺對(duì)照品51 mg至50 mL容量瓶，用10 mL甲醇溶解后，再加入上述3，5，6-三氯水楊酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸溶液各1 mL，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得。空白輔料溶液：取不含五氯柳胺的空白輔料適量(約2 mL)，精密稱定，于100 mL容量瓶中用20 mL甲醇溶解，充分混勻后，再用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。離心后取上清液進(jìn)樣。供試品溶液：取本品適量(約相當(dāng)于五氯柳胺102 mg)，精密稱定，于100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解，并充分混勻后，再用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。離心后取上清液進(jìn)樣。按色譜條件，精密量取20 μL的3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、專屬性溶液、空白輔料溶液、供試品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖?？瞻纵o料溶液峰、3，5，6-三氯水楊酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽峰分離度均大于1.5，不干擾主峰測(cè)定，表明該方法專屬性好。記錄色譜圖。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。3，5，6-三氯水楊酸溶液配制：精密量取3，5，6-三氯水楊酸對(duì)照品10.2 mg于20 mL容量瓶中，用2 mL四氫呋喃溶解，并用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成510 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸對(duì)照品溶液。2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液配制：精密稱取2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽對(duì)照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度(必要時(shí)可超聲溶解)，搖勻，配制成約510 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液。五氯柳胺對(duì)照品溶液：精密稱取五氯柳胺對(duì)照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用4 mL甲醇溶解，并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配制成510 μg·mL-1的五氯柳胺對(duì)照品溶液。分別準(zhǔn)確移取510 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液和五氯柳胺對(duì)照品溶液各5 mL于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，配制成含102 μg·mL-1濃度的各雜質(zhì)溶液；將其依次稀釋，配制成約含各雜質(zhì)濃度為20.40、10.20、5.10、2.04、0.51 μg·mL-1的雜質(zhì)混合溶液。分別取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制峰面積(y)-質(zhì)量濃度(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

進(jìn)樣精密度。取線性測(cè)試項(xiàng)下的0.51 μg·mL-1的雜質(zhì)混合溶液，照色譜條件連續(xù)進(jìn)6針，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD。計(jì)算峰面積RSD。

中間精密度。取同一批均勻樣品，按照供試品溶液配制方法配制6份供試品溶液，由一名試驗(yàn)員按方法規(guī)定分別測(cè)定上述6個(gè)樣品。由另一名試驗(yàn)員按方法規(guī)定，在不同一天選擇不同的儀器，另外分別配制和測(cè)定6個(gè)樣品。記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

定量限和檢測(cè)限。配制2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸和五氯柳胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其依次稀釋，進(jìn)樣分析，計(jì)算信噪比，當(dāng)信噪比為3時(shí)，該濃度為檢測(cè)限，信噪比為10時(shí)，該濃度為定量限。

準(zhǔn)確度。精密稱定五氯柳胺混懸液適量(約相當(dāng)于含五氯柳胺51 mg)于50 mL容量瓶中，并加入處方輔料，加入10 mL甲醇溶解，加入適量2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和3，5，6-三氯水楊酸，配制成含各雜質(zhì)濃度約為0.35、5.8、20.4 μg·mL-1的雜質(zhì)混合溶液各3份，精密量取20 μL，進(jìn)樣，計(jì)算回收率。

溶液穩(wěn)定性：按照對(duì)照溶液及供試品溶液配制方法，分別配制對(duì)照溶液及供試品溶液，分別測(cè)定新配制樣品及在樣品箱中放置48 h后的樣品溶液。

耐用性試驗(yàn)：照專屬性試驗(yàn)中專屬性溶液、供試品溶液及對(duì)照溶液配制方法，配制專屬性溶液、供試品溶液及對(duì)照溶液，分別考察流速改變±0.2 mL·min-1、柱溫改變±5℃、流動(dòng)相比例改變± 2%以及選用不同批號(hào)或不同廠家色譜柱的儀器色譜行為變化，觀察基線分離情況，計(jì)算各條件下所得數(shù)據(jù)的平均值及RSD。

有關(guān)物質(zhì)檢查：照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法項(xiàng)下方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照溶液，分別取20 μL進(jìn)樣。供試品溶液記錄的色譜圖中，如有雜質(zhì)峰(不包括溶劑峰)，單個(gè)雜質(zhì)不得超過0.5%，總雜質(zhì)含量不得超過1.0%。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 專屬性試驗(yàn)

輔料干擾峰及雜質(zhì)3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽產(chǎn)生的峰與主峰完全分離，分離度均大于1.5，證明該方法專屬性好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積y為縱坐標(biāo)，以五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制峰面積(y)-質(zhì)量濃度(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=237288.952c+18980.896，決定系數(shù)R2=1.000，表明該方法可用于五氯柳胺混懸液含量測(cè)定。

2.1.3 進(jìn)樣精密度

連續(xù)進(jìn)6針五氯柳胺對(duì)照品溶液，其峰面積分別為1 6154 972、16 145 538、16 157 408、16 159 043、16 173 572、16 183 977，RSD為0.1%，小于2.0%，表明本方法的進(jìn)樣精密度良好。

2.1.4 中間精密度

由表1結(jié)果可知，第1人測(cè)得含量RSD為0.36%，第2人測(cè)定含量RSD為0.11%，平均RSD為0.23%，均小于2.0%，表明該方法中間精密度好。

2.1.5 準(zhǔn)確度

由表2結(jié)果可知，3個(gè)濃度下的回收率分別為100.43%、99.97%、99.97%，平均回收率為100.12%，回收率RSD<2%，證明該方法回收率好。

2.1.6 溶液穩(wěn)定性

供試品溶液在室溫下放置30 h后，其峰面積未發(fā)生明顯變化，峰面積RSD=0.1%，小于2.0%，表明本樣品在室溫下放置30 h穩(wěn)定。

表1中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

Table1Results of intermediate precision

人員Personnel重復(fù)Repeats含量Content/%平均含量Average content/%RSD/%甲1106.6106.220.36A2106.63105.94105.85106.56105.9乙1107.3107.500.11B2107.53107.54107.65107.56107.6

2.1.7 耐用性試驗(yàn)

由表3結(jié)果可知，主峰與雜質(zhì)峰均達(dá)到基線分離，在流速改變 ± 0.2 mL·min-1、柱溫改變±5℃、流動(dòng)相比例改變±2%，以及選用不同批號(hào)或不同廠家色譜柱條件下所測(cè)主成分標(biāo)示含量的RSD均小于2.0%，說明流動(dòng)相比例、柱溫及流速等條件的微小變化對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無顯著影響，表明該方法耐用性好。

2.1.8 樣品含量

參照含量測(cè)定方法，測(cè)定3批中試樣品的含量，3批中試樣品含量分別為100.9%、101.1%、101.0%，均在標(biāo)示量范圍(95%～105%)內(nèi)。

2.2 五氯柳胺混懸液有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.2.1 專屬性試驗(yàn)

空白輔料溶液峰、雜質(zhì)3，5，6-三氯水楊酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽峰與主峰分離度均大于1.5，不干擾主峰測(cè)定，表明該方法專屬性好。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table2Results of recovery

理論濃度Theoretical concentration/(μg·mL-1)重復(fù)Repeats實(shí)際濃度Actual concentration/(μg·mL-1)回收率Recovery/%平均回收率Average recovery/%RSD/%34134.18190100.5100.430.06234.12455100.4334.13033100.468168.00144100.099.970.06267.9616999.9368.01171100.01041104.2706299.999.970.062104.32736100.03104.36308100.0

表3含量測(cè)定耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table3Durability results of content determination

變化項(xiàng)Change items主峰及各雜質(zhì)峰基線分離Separation of the main peakfrom the adjacent peak含量Content/%平均含量Averagecontent/%RSD/%柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃是Yes104.8105.20.83柱溫不變 Column temperature unchanged是Yes106.2柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃是Yes104.6流動(dòng)相比例-2% Proportion of mobile phase-2%是Yes105.1105.50.58流動(dòng)相比例不變 proportion of mobile phase unchanged是Yes106.2流動(dòng)相比例+2% Proportion of mobile phase+2%是Yes105.2流速-10% Flow rate-10%是Yes104.6105.30.78流速不變 Flow rate unchanged是Yes106.2流速+10% Flow rate+10%是Yes105.1色譜柱1 Column 1是Yes100.5100.70.17色譜柱不變 Column unchanged是Yes100.5色譜柱2 Column 2是Yes100.8色譜柱3 Column 3是Yes100.8

2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=130721.123c+36630.203，其相關(guān)系數(shù)為0.996；3，5，6-三氯水楊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=123451.705c+2478.855，其相關(guān)系數(shù)為1.000；五氯柳胺標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=318112.192c-11199.561，其相關(guān)系數(shù)為1.000，線性關(guān)系良好。表明以上標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于五氯柳胺混懸液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

2.2.3 進(jìn)樣精密度

由表4可知，連續(xù)進(jìn)6針雜質(zhì)混合溶液，已知雜質(zhì)2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽峰面積RSD為3.73%，3，5，6-三氯水楊酸峰面積RSD為0.24%，五氯柳胺峰面積RSD為0.17%，均小于2.0%，表明本方法的進(jìn)樣精密度良好。

2.2.4 中間精密度

由表5可知，已知雜質(zhì)2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和3，5，6-三氯水楊酸在供試品溶液中未檢出，2個(gè)人員測(cè)得的總雜質(zhì)RSD均為0，平均RSD為0，表明該方法中間精密度好。

2.2.5 定量限和檢測(cè)限

表4進(jìn)樣精密度

Table4Results of injection precision

樣品名Sample names濃度Content/(μg·mL-1)重復(fù)Repeats峰面積Peak area平均峰面積Average areaRSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽5.078017171886925653.732-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride269337036942414718508568403366480523,5,6-三氯水楊酸4.984016176776172140.243,5,6-trichlorosalicylic acid26166583615636461975856159646617588五氯柳胺5.04791159025015854630.17Oxyclozanide2158584331583286415861455158322661584028

表5中間精密度

Table5Results of intermediate precision

人員Personel重復(fù)Repeats雜質(zhì)含量Impurity content/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽2-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride3,5,6-三氯水楊酸3,5,6-trichlorosalicylic acid總雜質(zhì)Total impurityRSD/%甲1<0.05<0.050.320A2<0.05<0.050.323<0.05<0.050.324<0.05<0.050.325<0.05<0.050.326<0.05<0.050.32乙1<0.05<0.050.300B2<0.05<0.050.303<0.05<0.050.304<0.05<0.050.305<0.05<0.050.306<0.05<0.050.30

試驗(yàn)結(jié)果表明：2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽定量限為0.064 8 μg·mL-1，檢測(cè)限為0.019 6 μg·mL-1；3，5，6-三氯水楊酸定量限為0.097 9 μg·mL-1，檢測(cè)限為0.029 7 μg·mL-1；五氯柳胺溶液定量限為0.141 8 μg·mL-1，檢測(cè)限為0.043 9 μg·mL-1。

2.2.6 準(zhǔn)確度

由表6可知，2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽平均回收率為110.3%，RSD均小于1%；3，5，6-三氯水楊酸平均回收率為98.6%，RSD均小于2%。證明該方法準(zhǔn)確度好。

2.2.7 溶液穩(wěn)定性

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，已知雜質(zhì)2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸未檢出，未知雜質(zhì)1及未知雜質(zhì)2放置48 h后含量未發(fā)生變化，雜質(zhì)1含量均為0.15%；雜質(zhì)2含量均為0.17%，總雜質(zhì)含量為0.3%。表明樣品在室溫下放置48 h穩(wěn)定。

2.2.8 耐用性

從專屬性溶液和樣品溶液耐用性測(cè)定結(jié)果(表7、表8)可以看出，隨著流動(dòng)相、流速、柱溫以及色譜柱的變化，色譜峰分離度均>1.5，理論塔

表62-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和3，5，6-三氯水楊酸回收率

Table6Recovery of 2-amino-4， 6-dichlorophenol hydrochloride and 3，5，6-trichlorosalicylic acid

雜質(zhì)名稱Impurity names理論濃度Theoreticalconcentration/(μg·mL-1)實(shí)際濃度Actual concentration/(μg·mL-1)回收率Recovery/%RSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽0.35100.35218100.30.72-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride0.35399100.80.35706101.75.09855.77210113.20.65.83414114.45.78723113.520.394023.82707116.80.323.73363116.423.69940116.23,5,6-三氯水楊酸0.51070.4750993.01.13,5,6-trichlorosalicylic acid0.4837294.70.4749293.05.10705.15447100.90.55.19728101.85.14725100.820.428020.69724101.30.320.60344100.920.58160100.8

表7專屬性溶液耐用性測(cè)定結(jié)果

Table7Durability of specific solution

樣品名Sample name變化項(xiàng)Change items保留時(shí)間Remain time/min理論塔板數(shù)Theoretical plate number分離度Resolution2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽正常條件Normal condition1.9834205—2-amino-4,6-dichlorophenol流動(dòng)相比例+2% Proportion of mobile phase+2%2.0674446—hydrochloride流動(dòng)相比例-2% Proportion of mobile phase-2%1.8174148—流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-12.2474782—流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-11.7073894—柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃1.8674267—柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃2.0004214—色譜柱1 Column 11.8032433—色譜柱2 Column 21.82728196.7色譜柱3 Column 33.1003438—色譜柱4 Column 41.8133450—

續(xù)表7

“—”表示未測(cè)得數(shù)據(jù)。

“ —” represent no data was measured.

表8樣品溶液耐用性試驗(yàn)結(jié)果

Table8Durability test of Sample solution

樣品名Sample names變化項(xiàng)Change items雜質(zhì)含量/%Content ofimpurity/%雜質(zhì)平均含量Averagecontent/%RSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽正常條件 Normal condition<0.052-amino-4,6-dichlorophenol柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃<0.05<0.05N/Ahydrochloride柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃<0.05流動(dòng)相比例-2% Proportion of mobile phase-0.2%<0.05<0.05N/A流動(dòng)相比例+2% Proportion of mobile phase+0.2%<0.05流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-1<0.05<0.05N/A流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-1<0.05色譜柱1 Column 1<0.05<0.05N/A色譜柱2 Column 2<0.05色譜柱3 Column 3<0.053,5,6-三氯水楊酸正常條件 Normal condition<0.053,5,6-trichlorosalicylic acid柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃<0.05<0.05N/A柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃<0.05流動(dòng)相比例-2% The proportion of mobile phase-0.2%<0.05<0.05N/A流動(dòng)相比例+2% The proportion of mobile phase+0.2%<0.05流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-1<0.05<0.05N/A流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-1<0.05色譜柱1 Column 1<0.05<0.05N/A色譜柱2 Column 2<0.05色譜柱3 Column 3<0.05

續(xù)表8

N/A代表不適用。

N/A represent not applicable.

板數(shù)均>2 400，已知雜質(zhì)能夠完全分離。流速改變±0.2 mL·min-1、柱溫改變±5 ℃、流動(dòng)相比例改變±2%及選用不同批號(hào)或不同廠家色譜柱，已知雜質(zhì)2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸在樣品中未能檢測(cè)出，總雜質(zhì)含量均小于1%，RSD均小于10%。試驗(yàn)結(jié)果表明，流動(dòng)相比例、柱溫、流速以及色譜柱等條件改變對(duì)有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果無明顯影響，說明該方法耐用性良好。

2.2.9 有關(guān)物質(zhì)

照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，測(cè)定3批中試樣品的有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果表明，3批中試樣品中2個(gè)未知雜質(zhì)含量均小于0.5%，總雜質(zhì)含量均小于1%(表9)。

表9有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

Table9he results of impurity determination %

3 討論

2013版英國(guó)藥典中采用紫外分光光度法測(cè)定五氯柳胺混懸液的含量，采用TLC法測(cè)定五氯柳胺混懸液有關(guān)物質(zhì)含量，以點(diǎn)濃度深淺來判斷已知雜質(zhì)2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸的濃度是否超過限度。上述2種方法靈敏度、準(zhǔn)確度和分離度均較差，且TLC方法不能準(zhǔn)確定量檢測(cè)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)定。HPLC方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，本研究建立了用于測(cè)定五氯柳胺混懸液含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法。

為了確定五氯柳胺混懸液的最大吸收波長(zhǎng)，按照對(duì)照品溶液及供試品溶液方法，配制對(duì)照品溶液及供試品溶液，采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定五氯柳胺的最大吸收波長(zhǎng)為300 nm，這一結(jié)果與英國(guó)藥典結(jié)果一致，所以選擇300 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)于流動(dòng)相的考察，首先分別選用乙腈-水及甲醇-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)五氯柳胺峰形較差，為了解決這一問題，向水相中加入0.1%的磷酸，以調(diào)整峰形。發(fā)現(xiàn)以0.1%磷酸-甲醇溶液作為流動(dòng)相時(shí)峰形優(yōu)于0.1%磷酸-乙腈溶液。

動(dòng)物寄生蟲病是動(dòng)物常發(fā)且造成巨大損失的傳染病，肝片吸蟲作為一種常見人畜共患病原體，長(zhǎng)期危害人類及動(dòng)物的健康，藥物防治是肝片吸蟲病防控的關(guān)鍵。五氯柳胺作為化學(xué)合成類抗肝片吸蟲藥物，具有性質(zhì)穩(wěn)定、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)，是新型、高效、安全的抗肝片吸蟲藥物，且該藥具備無污染、低殘留等良好的理化性質(zhì)，與其他具有相似作用的三氯苯達(dá)唑、氯苯碘柳胺、阿苯達(dá)唑等藥物相比，五氯柳胺至今未出現(xiàn)耐藥性的相關(guān)報(bào)道[20-21]，并憑借其顯著的治療效果在國(guó)外得到廣泛使用，是臨床抗蠕蟲感染的首選。至今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)五氯柳胺的研究停留在原料藥方面，尚未有五氯柳胺相關(guān)制劑的報(bào)道[22-24]。針對(duì)目前嚴(yán)重危害我國(guó)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全的動(dòng)物寄生蟲疾病，開發(fā)國(guó)內(nèi)新型動(dòng)物專用抗寄生蟲病藥物五氯柳胺及其制劑，對(duì)解決目前我國(guó)所使用的抗寄生蟲藥物存在的耐藥性、副反應(yīng)大和治療效果不確實(shí)等問題具有重大的意義。建立完善的五氯柳胺混懸液含量及有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，為控制產(chǎn)品質(zhì)量提供有效的分析手段及理論依據(jù)，對(duì)產(chǎn)品的安全使用具有重要意義。