長薄鰍惡臭假單胞菌的分離鑒定及其感染的病理損傷

白明煥，耿 毅，*，鄧龍君，甘維熊，周 劍，黃小麗，陳德芳，歐陽萍，趙若璇，諶冰潔

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.雅礱江流域水電開發(fā)有限公司，四川 成都 610056； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)屬假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，革蘭陰性桿菌，廣泛分布于土壤、水體中，是一種條件致病菌，可感染兩棲類、魚類和甲殼類等多種水生動物。現(xiàn)已有大鯢(Andriasdavidianus)[1]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[2]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[3]、條石鯛(Japaneseparrotfish)[4]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[5]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergiideman)[6]、黑鯛(Sparusmacrocephlus)[7]、雜交鱘(hybrid sturgeon)[8]、雜交鲇(hybrid catfish)[9]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[10]及虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[11]等感染，并引起全身多器官出血、壞死，甚至死亡的報道。

長薄鰍(Leptobotiaelongata)為鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、薄鰍屬(Leptobotia)魚類，俗名花鰍、紅沙鰍鉆等，是中國的特有物種，主要分布于長江宜賓江段及其臨近水域。魚體兩側(cè)有鮮艷的花斑，具有極高的觀賞價值，同時其肉富含蛋白質(zhì)、脂肪、必需氨基酸以及人體所需的鈣磷等常量元素[12]，是觀賞和食用價值兼?zhèn)涞拿F魚類。隨著長江流域的過度捕撈以及大量水利工程的修建，導(dǎo)致長薄鰍的棲息地環(huán)境遭到破壞，其資源量和漁獲量不斷下降，已被列入《中國瀕危動物紅皮書》和《中國物種紅色名錄》。近年來，隨著長薄鰍人工繁殖的成功，其養(yǎng)殖逐漸興起，并被列為重要的增殖放流對象。2017年8月，四川省西昌市某養(yǎng)殖場的長薄鰍陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病死亡，主要表現(xiàn)為體表潰爛、出血等癥狀，為明確其病因，本研究從自然發(fā)病魚體內(nèi)進(jìn)行了病原菌的分離，并通過表型特性測定、16S rRNA和gyrB基因序列分析確定其病原為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，同時進(jìn)行了病理損傷觀察，以期為長薄鰍疾病的診斷和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病魚，體質(zhì)量355.3～426.8 g，采自四川省西昌市某養(yǎng)殖場；健康魚，體質(zhì)量112.7～131.6 g，購于四川省宜賓市某養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基、細(xì)菌基因組提取試劑盒、藥敏紙片、細(xì)菌生化微量鑒定管、PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒。

1.3 剖檢變化與組織病理學(xué)觀察

對病魚進(jìn)行系統(tǒng)解剖，對各組織、器官的病理損傷觀察，并取鰓絲、鰭條以及體表黏液進(jìn)行寄生蟲檢查。同時取患病魚的心、肝、脾、腎等組織，4%的甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察其組織學(xué)損傷。

1.4 病原菌分離及形態(tài)觀察

無菌條件下，從病魚的肝、脾與腎等取樣，LB平板上畫線，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑取形狀、大小、顏色均勻一致的優(yōu)勢單個菌落再次接種LB平板進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察菌落與細(xì)菌形態(tài)特征。獲得純化后的菌株4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 生理生化測定及藥敏試驗

生理生化特性采用微量生化法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]進(jìn)行。藥敏試驗采用K-B法進(jìn)行，將新鮮菌液用無菌棉簽均勻涂布于MH平板，28 ℃培養(yǎng)24 h測定抑菌圈的直徑并判定結(jié)果，敏感度根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.6 人工感染試驗

將分離菌接種于LB肉湯，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)至3.0×108、3.0×107、3.0×106和3.0×105CFU·mL-1，健康長薄鰍于水溫(20±1)℃中暫養(yǎng)7 d后，腹腔注射菌液0.2 mL·尾-1，每組20尾；對照組注射等量的生理鹽水。接種后每天觀察魚的臨床表現(xiàn)及死亡情況，試驗期14 d。對感染后的病死魚及時進(jìn)行解剖，并進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

1.7 16S rRNA和gyrB基因序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

取對數(shù)生長期新鮮菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用16S rRNA的通用引物[14]與gyrB基因的通用引物[15](表1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，共35次循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將純化回收的PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。將獲得的分離菌16S rRNA與gyrB基因序列和已知GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，使用MEGA 7.1用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1細(xì)菌16S rRNA和gyrB基因引物序列

Table1Primer sequence of bacterial 16S rRNA andgyrBgene

引物Primer序列Sequence(5′-3′)DNA片段DNA fragments/bp16S ForwardAGAGTTTGATCCTGGCTCAG150016S ReverseGGCTACCTTGTTACGACTTgyrB ForwardGAAGGCGGNACNCAYGAAG1200gyrB ReverseCTTCRTGNGTNCCGCCTTC

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀與剖檢變化

發(fā)病長薄鰍表現(xiàn)為食欲不振，游動緩慢，常浮于水面。病魚的鰓蓋邊緣及胸鰭基部出血及潰瘍灶，胸腹部點狀出血，體表尤其是尾部見大小不等的潰爛，病程長的病例在潰瘍灶可見水霉著生(圖1-A)。剖檢見鰓絲充血、腫脹，呈深紅色；肝淤血、腫大，質(zhì)脆，呈花斑狀(圖1-B)，脾與腎腫大，呈暗紅色；胃腸道空虛，腸腔內(nèi)充有較多的黏液。鰓絲壓片與體表黏液涂片鏡檢，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。

2.2 病原菌分離及形態(tài)觀察

從發(fā)病長薄鰍肝、腎與脾內(nèi)分離獲得3株優(yōu)勢菌(BMH170819、BMH170820、BMH170821)，28 ℃培養(yǎng)24 h后，在LB培養(yǎng)基上形成表面濕潤光滑，微隆起，邊緣整齊，直徑1.5～2.5 mm的淡黃色半透明的菌落。3株菌經(jīng)革蘭氏染色均呈G-桿菌，大小為0.5～1.0 μm×1.5～4.0 μm(圖2)。

A，鰓蓋邊緣潰瘍，胸鰭基部與胸部出血；B，肝淤血，腫大。A， Ulcers were on the edge of the operculum and punctate hemorrhage were at the base of the pectoral fin and the breast; B， Congestion and swelling of liver.圖1 患病長薄鰍的剖檢變化Fig.1 Gross lesions of diseased Leptobotia elongate

2.3 分離菌生理生化特性及藥敏試驗

分離菌的主要生理生化特性見表2，3株分離菌的主要生化特性相同且與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的生理生化特性基本一致，初步判定其為P.putida。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，3株菌均對新霉素、慶大霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素等敏感，對氨芐西林、阿莫西林、林可霉素、氟苯尼考、克林霉素等耐藥，詳見表3。

圖2 分離株革蘭氏染色形態(tài)Fig.2 Micrograph of strain in Gram staining

2.4 分離菌人工感染試驗

由于3株分離菌的生理生化特性及藥物敏感性完全一致，故選其中一株(BMH170820)進(jìn)行人工感染試驗。攻毒24 h后，細(xì)菌濃度為3.0×108、3.0×107CFU·mL-1試驗組的長薄鰍出現(xiàn)采食量下降、游動無力等臨床癥狀，濃度為3.0×106、3.0×105CFU·mL-1的長薄鰍陸續(xù)從注射后的3～4 d開始出現(xiàn)臨床癥狀。隨著病情的發(fā)展，發(fā)病長薄鰍的體表開始出現(xiàn)出血點、潰瘍、爛斑、鰭條出血等。濃度為3.0×108CFU·mL-1的試驗組，從第3天開始出現(xiàn)死亡，其余組則在感染后4～5 d開始出現(xiàn)死亡，到試驗結(jié)束時，各感染組的死亡率分別為85%、65%、30%和10%；而對照組的長薄鰍在試驗期間無異常。從人工感染發(fā)病死亡的長薄鰍體內(nèi)再次分離細(xì)菌，獲得與感染接種菌形態(tài)、理化特性及16S rRNA基因序列一致的菌株。

2.5 16S rRNA和gyrB基因序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用擴(kuò)增16S rRNA基因和gyrB基因的通用引物，分別擴(kuò)增得到1 500、1 200 bp的片段，純化測序后將序列提交NCBI獲得GenBank登錄號分別為MH155971和MH396435。將獲得的16S rRNA和gyrB基因序列與GenBank中已有的序列進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示，菌株BMH170820與數(shù)據(jù)庫中的惡臭假單胞菌同源性最高。在基于分離菌的16S rRNA和gyrB序列與GenBank中已有的假單胞菌屬細(xì)菌16S rRNA及gyrB基因序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹上(圖3)，該分離菌株與P.putida聚為一族。

表2分離株BMH170819-BMH170821生理生化特性

Table2Biochemical and physiological characteristics of isolated strain BMH170819-BMH170821

試驗項目ItemsBMH170819-BMH170821P. putida[13]P. putida[9]運(yùn)動性 Motility++N/A精氨酸雙水解酶 Arginine dihydrolase+++鳥氨酸脫羧酶 Ornithine decarboxyla---賴氨酸脫羧酶 Lysin decarboxylase---接觸酶 Catalase++N/A脲酶 Urease--+氧化酶 Oxidase+++H2S 產(chǎn)生 H2S production---檸檬酸鹽 Citrate+++吲哚反應(yīng) Indole test---甘露醇Mannitol---明膠 Gelatin---硝酸鹽還原 Nitrate reduction+++V-P 試驗 V-P test---半乳糖ONPG-N/A-葡萄糖產(chǎn)氣 Glucose gas--N/A甲基紅 Methyl red---麥芽糖 Maltose---木糖 Xylose--+果糖 Fructose++N/A

+，陽性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)；N/A，未測定。

+， Positive; -， Negative; N/A， No determination.

表3分離株BMH170819-BMH170821的藥敏試驗結(jié)果

Table3Antibiotics sensitivities of the isolated strain BMH170819-BMH170821

藥敏種類Drugs判斷標(biāo)準(zhǔn)Standard/mm耐藥(R)中敏(I)敏感(S)抑菌圈直徑Diameter of inhibitory zone/mm結(jié)果Result新霉素Neomycin≤1213～16≥1718S慶大霉素Gentamicin≤1213～14≥1524S氨芐西林Ampicillin≤1314～16≥170R阿莫西林Amoxicillin≤1314～17≥180R四環(huán)素Tetracycline≤1415～18≥1926S氧氟沙星Ofloxacin≤1213～15≥1630S頭孢氨芐Cefalexin≤1415～17≥180R多粘菌素B Polymyxin B≤89～11≥1217S恩諾沙星Enoxacin≤2122～28≥2930S林可霉素Lincomycin≤2324～30≥310R鏈霉素Streptomycin≤1112～14≥1516S諾氟沙星Norfloxacin≤1213～16≥1728S丁胺卡那Amikacin≤1415～16≥1726S青霉素Penicillin≤1920～27≥280R紅霉素Erythromycin≤1314～22≥230R氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥180R克林霉素Clindamycin≤1415～20≥210R強(qiáng)力霉素Doxycycline≤1213～15≥1626S

S，敏感；I，中度敏感；R，耐藥。

S， Sensitive; I， Moderately sensitive; R， Resistant.

2.6 組織病理損傷觀察

肝竇淤血，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞顆粒變性，細(xì)胞體積顯著增大，胞漿淡染，局部肝細(xì)胞空泡變性(圖4-A)；鰓小片上皮細(xì)胞壞死并脫落，鰓小片間有大量淡紅染的滲出物與炎癥細(xì)胞(圖4-B)；腸道黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，碎片散落于腸腔(圖4-C)，固有膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤；心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，顆粒變性，甚至溶解壞死，肌間隙內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(圖4-D)；脾臟明顯淤血、出血，黑色素巨噬細(xì)胞中心擴(kuò)大，數(shù)量增多，淋巴細(xì)胞顯著減少，大量黃鐵血黃素沉著(圖4-E)；腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性，甚至壞死，管腔內(nèi)見均質(zhì)紅染的蛋白或脫落的上皮細(xì)胞形成的管型，腎間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與中性白細(xì)胞浸潤(圖4-F)。

3 討論

假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌廣泛分布于土壤、淡水、海水中，其中的部分種類對水生動物的致病性逐步被發(fā)現(xiàn)，已有熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)感染錦鯉[16]、鱖[17]，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染河豚[18]，惡臭假單胞菌感染雜交鱘[8]、雜交鲇[9]、大黃魚[10, 19]以及三疣梭子蟹[5]等的報道，尤其是惡臭假單胞菌具有較為廣泛的感染宿主，已受到人們的高度關(guān)注。長薄鰍作為我國特有的瀕危物種，其保護(hù)與開發(fā)受到了社會的高度重視，相繼開展了馴化、人工繁殖與養(yǎng)殖等研究與實踐工作，但對于其疾病的研究還相當(dāng)缺乏。本研究從患病長薄鰍體內(nèi)分離出菌株BMH170820，經(jīng)人工感染確定該分離菌的病原性，并通過16S rRNA和gyrB基因測序分析，結(jié)合菌落和細(xì)菌形態(tài)以及生理生化特性鑒定其為惡臭假單胞菌。由此可見，惡臭假單胞菌自然情況下也可感染長薄鰍致死亡，因此，在長薄鰍的養(yǎng)殖中應(yīng)重視該病的危害。

圖3 基于16S rRNA基因序列(A)與gyrB基因序列(B)構(gòu)建的菌株BMH170820與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic trees based on 16S rRNA (A) and gyrB gene (B) sequence of the isolated strain BMH170820 and other related species in Pseudomonas genus

據(jù)報道，歐洲鰻鱺[2]和羅氏沼蝦[6]感染時病變主要集中在鰓，表現(xiàn)為鰓絲潰爛；中華絨螯蟹[3]感染時主要表現(xiàn)為腳爪無力，容易脫落；而三疣梭子蟹[5]感染時表現(xiàn)為內(nèi)臟和肌肉組織溶解為乳白色的液體；以及黑鯛[7]和雜交鱘[8]主要表現(xiàn)為腸炎等。本研究中惡臭假單胞菌感染長薄鰍主要表現(xiàn)為體表潰瘍、出血，以及對肝、脾、腎，鰓和心等多組織器官的損傷?？梢姡瑦撼艏賳伟腥静煌乃拗骺赡芫哂胁煌呐R床特征與病理損傷特點，造成這種差異的原因是與宿主種屬特性有關(guān)，還是與菌株的差異有關(guān)值得進(jìn)一步研究。此外，該菌對人體的感染率也呈上升趨勢，能引起葡萄球菌樣燙傷性皮膚綜合征[20]、敗血癥[21]、食物中毒[22-23]、傷口感染[24-25]等。因此，惡臭假單胞菌不僅對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害嚴(yán)重，而且對人類健康也構(gòu)成威脅，應(yīng)給予高度重視。

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，惡臭假單胞菌的耐藥率也有上升的趨勢，耐藥菌株感染也越來越多，給治療帶來困難[26-27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，從長薄鰍分離到的惡臭假單胞菌(BMH170820)對四環(huán)素、氧氟沙星、恩諾沙星以及強(qiáng)力霉素等10種抗生素敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、頭孢氨芐、林可霉素等8種抗生素耐藥。這與楊圓圓等[8]報道雜交鱘源惡臭假單胞菌對氟苯尼考敏感；毛芝娟等[7]報道黑鯛源惡臭假單胞菌對氧氟沙星耐藥；Holmgaard等[28]報道人源惡臭假單胞菌對強(qiáng)力霉素耐藥的結(jié)果存在較大的差異。此外，Holmgaard等[28]還報道，從丹麥分離的人源惡臭假單胞菌具有包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等6種耐藥基因，Peter等[29]也證實韓國分離的不同菌株間的耐藥基因存在差異，這表明不同菌株間存在耐藥性差異。因此，臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥物敏感性試驗結(jié)果選擇用藥，以避免藥物的濫用。另外，由于疾病發(fā)生除了病原因素之外，還與環(huán)境、機(jī)體等因素有關(guān)，因此，有必要開展惡臭假單胞菌感染相關(guān)的環(huán)境風(fēng)險因素的研究，以明確不同環(huán)境因子在發(fā)病風(fēng)險中的作用，為養(yǎng)殖過程通過環(huán)境調(diào)控降低該病的發(fā)生風(fēng)險提供依據(jù)。人類醫(yī)學(xué)已發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌的感染往往與機(jī)體的免疫力低下相關(guān)，因此，在長薄鰍的養(yǎng)殖過程適時使用微生態(tài)制劑與免疫增強(qiáng)劑，改善正常菌群[30]，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)動物抵抗力[31]也可能是防控該菌感染的重要策略。

A，肝細(xì)胞顆粒變性，空泡變性；B，鰓小片上皮細(xì)胞壞死、脫落，炎癥細(xì)胞浸潤；C，腸黏膜上皮細(xì)胞壞死，脫落；D，心肌纖維變性，壞死，溶解；E，脾出血，淋巴細(xì)胞減少；F，腎小管上皮細(xì)胞變性，壞死，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。A， Granular and vacuolar degeneration in hepatocytes; B， Epithelial necrosis and abscission of the lamellae along with infiltration of inflammatory cells; C， Epithelial necrosis and abscission in intestinal mucosa; D， Degeneration， necrosis and myolysis of myocardial fiber; E， Hemorrhage and lymphocytopenia in spleen; F， Degeneration and necrosis in renal tubular epithelia and inflammatory cell infiltration of renal interstitium.圖4 感染惡臭假單胞菌長薄鰍的組織病理學(xué)損傷(HE)Fig.4 Histopathological lesions of Leptobotia elongate infected by P. putida(HE)