利用流式細(xì)胞法鑒定馬鈴薯倍性方法的優(yōu)化

王婷婷，張光海，蔡汶玻，郭華春

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201）

流式細(xì)胞法（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞分析儀檢測植物細(xì)胞DNA含量，分析得到DNA含量直方圖，根據(jù)DNA含量直方圖的峰值位置推斷出植株的倍性。由于細(xì)胞在有絲分裂的過程中，核內(nèi)的DNA會進(jìn)行復(fù)制，造成DNA含量的變化。如果把處于G0/G1期的細(xì)胞的DNA含量看作2n的話，處于G2/M期的細(xì)胞的DNA含量則為4n，所以FCM可以準(zhǔn)確快速地鑒定大批量植物材料的染色體倍性水平[1,2]。流式細(xì)胞術(shù)可以測定液體懸浮液中熒光和微小粒子的光散射（熒光標(biāo)記的微粒）。由于其快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，F(xiàn)CM在20世紀(jì)80年代，代替細(xì)胞熒光光度法和顯微分光光度測定法，成為測定植物細(xì)胞核DNA含量的主流方法，其原理是利用特異的熒光染色劑對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀測定熒光含量[3,4]。由于所使用的熒光染色劑大多為核酸熒光染料，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基特異性結(jié)合，所以熒光的含量與細(xì)胞DNA含量成正比關(guān)系，隨著染色體數(shù)目的成倍增加，細(xì)胞核DNA含量也必然成倍增加，細(xì)胞核DNA相對含量的高低與細(xì)胞的倍性密切相關(guān)，根據(jù)細(xì)胞核DNA含量的高低可進(jìn)行倍性鑒定。常用的熒光染料有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、異硫氰基熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）等[5-7]。FCM短時(shí)間內(nèi)可以測定大量的細(xì)胞核，樣品需求量小，不會影響植物的正常生長。且樣品制備僅需要幾分鐘，而且不需要昂貴的試劑。流式細(xì)胞術(shù)簡便、快速、分辨率和準(zhǔn)確度高，鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在多種植物的染色體倍性鑒定中得以應(yīng)用。例如，蘋果[5]、梨[8]、桑樹[9]、菘藍(lán)[10]、草莓[11]、 水稻[12]、櫻桃[13]等。

馬 鈴 薯（Solanum tuberosum L.）屬 于 茄 科（Solanaceae）茄屬（Solanum）一年生，草本植物，起源于南美洲的秘魯和智利地區(qū)[14]。馬鈴薯普通栽培種分為2個(gè)亞種，分別為長日照普通栽培種亞種（S.tuberosum subsp.tuberosum）和短日照安第斯亞種（S.tuberosum subsp.andigena），經(jīng)過幾個(gè)世紀(jì)的自然進(jìn)化選擇，形成了目前世界各國廣泛栽培的普通栽培種（Solanum tuberosum L.）[15]。馬鈴薯倍性豐富，染色體基數(shù)為n=12，自然界中分布有二倍體（2n=24）、三倍體（2n=36）、四倍體（2n=48）、五倍體（2n=60）、六倍體（2n=72）[16]。這些是改善栽培馬鈴薯的重要基因資源，可以為育種工作提供具有理想遺傳背景的材料，而馬鈴薯的倍性鑒定則是開展野生種馬鈴薯育種應(yīng)用研究的基礎(chǔ)和前提[17,18]。

盡管關(guān)于馬鈴薯倍性鑒定方法已有很多研究報(bào)道，但利用流式細(xì)胞法鑒定馬鈴薯倍性方面的報(bào)道仍然較少。本試驗(yàn)借鑒流式細(xì)胞法在其他植物染色體倍性鑒定方面的研究，通過篩選適合制備馬鈴薯幼葉單細(xì)胞核懸浮液的緩沖液，比較離心和不離心及不同染料對結(jié)果的影響，期望利用流式細(xì)胞術(shù)建立一套適合鑒定馬鈴薯染色體倍性的方法，快速準(zhǔn)確地鑒定馬鈴薯倍性，從而為馬鈴薯的倍性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

二倍體馬鈴薯品系‘E’和四倍體馬鈴薯‘青薯9號’為研究對象，取在MS培養(yǎng)基中正常生長3周左右的幼嫩葉片為試驗(yàn)材料。流式細(xì)胞儀（BD FACSAriaTMⅡ）。

1.2 細(xì)胞核分離緩沖液的配制

細(xì)胞核分離緩沖液Ⅰ（LB01）：15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L腈胺，80 mmol/L KCl， 20 mmol/L NaCl， 0.1%（v/v）Trition X-100，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，0.22 μm濾膜過濾除菌，再加15 mmol/L β-巰基乙醇；分裝后-20℃保存。

細(xì)胞核分離緩沖液Ⅱ（Galbraith's buffer）：45 mmol/L MgCl2，20 mmol/L MOPS，30 mmol/L檸檬 酸 鈉 ， 0.1%（v/v）Trition X-100； 用 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，0.22 μm濾膜過濾除菌；分裝后-20℃保存。

細(xì)胞核分離緩沖液Ⅲ（Tris·MgCl2buffer）：200mmol/L Tris， 4 mmol/L MgCl2， 0.5%（v/v）Trition X-100；用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.5，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存。

1.3 馬鈴薯葉片細(xì)胞核懸浮液的制備

選用上述3種核分離緩沖液，取約20 mg正常生長3周左右的馬鈴薯‘E’組培苗葉片，置于預(yù)冷的培養(yǎng)皿中央，加入1 mL預(yù)冷的核分離緩沖液，使材料完全浸沒在解離液中，然后用鋒利的雙面刀片迅速切碎，切的過程中樣品應(yīng)始終接觸緩沖液。將勻漿混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將預(yù)先浸泡在解離液中400目的濾膜取出，用此濾膜將勻漿過濾到1.5 mL離心管中[19]。

1.4 離心漂洗次數(shù)選擇

采用1.3的方法，加入1 mL預(yù)冷的LB01緩沖液，分別進(jìn)行不離心和離心1次的比較試驗(yàn)。離心1次的試驗(yàn)條件為4℃，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，再加200 μL LB01緩沖液。

1.5 染色劑的選擇

在用LB01緩沖液制備的單細(xì)胞核懸浮液中，分別加入 PI（50 μg/mL）染料和 DAPI（5 μg/mL）染料，注意加PI染料的核懸浮液中要同時(shí)加入質(zhì)量濃度為50 μg/mL的核糖核酸酶（RNase）。4℃避光染色30 min，并輕搖混勻。

1.6 上機(jī)檢測與數(shù)據(jù)分析

用BD FACSAriaTMⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，調(diào)節(jié)參數(shù)，每個(gè)經(jīng)過染色的樣品收集10 000個(gè)細(xì)胞核，利用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而獲得流式峰值圖（橫坐標(biāo)為細(xì)胞核DNA相對含量的熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞核數(shù)量）和散點(diǎn)圖（橫坐標(biāo)為細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞通過激光的時(shí)間）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同緩沖液的效果比較

圖1 不同解離液下二倍體馬鈴薯品系‘E’單細(xì)胞核懸浮液的相對DNA含量直方圖和散點(diǎn)圖Figure 1 Peak valuehistogram and scatter diagram ofsinglecellsuspension solution for relativeDNA contentsusing different dissociation buffersin diploid potato line'E'

取約20 mg正常生長3周左右的二倍體馬鈴薯品系‘E’組培苗幼嫩葉片，分別用核分離緩沖液Ⅰ（LB01）、核分離緩沖液Ⅱ（Galbraith's buffer）和核分離緩沖液Ⅲ（Tris·MgCl2buffer）制備馬鈴薯單細(xì)胞核懸浮液，檢測結(jié)果見圖1。使用3種緩沖液制備的馬鈴薯幼葉細(xì)胞核懸浮液，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測均可產(chǎn)生非常明顯的峰。核分離緩沖液Ⅰ（LB01）（圖1-a）的解離效果明顯優(yōu)于Galbraith's buffer（圖 1-b）和 Tris·MgCl2buffer（圖 1-c）。LB01解離液得到的散點(diǎn)圖中，粒子團(tuán)清晰、集中，2個(gè)細(xì)胞群可以完全分開，收集到的完整細(xì)胞核較多，在熒光通道值為200處附近出現(xiàn)G1峰，G1峰和G2峰可以完全分開，峰值較為準(zhǔn)確（圖1-a-2）。而Galbraith's buffer和Tris·MgCl2buffer制備的核懸浮液中（圖1-b-2和圖1-c-2），2個(gè)細(xì)胞群不能完全分開，反映在直方圖上則表現(xiàn)為G1峰和G2峰不能完全分開，主峰位置明顯發(fā)生偏移。因此，核分離緩沖液LB01可作為制備馬鈴薯幼葉單細(xì)胞核懸浮液的最優(yōu)解離液。

2.2 離心和不離心的效果比較

取二倍體馬鈴薯品系‘E’組培苗新鮮幼嫩葉片制備的馬鈴薯單細(xì)胞核懸浮液，進(jìn)行不離心（圖2-a）和離心1次（圖2-b）的試驗(yàn)，檢測結(jié)果如圖2所示。從圖2-a-2和圖2-b-2看出兩者均表現(xiàn)為粒子團(tuán)集中、清晰，2個(gè)細(xì)胞群可以完全分開，反映在直方圖上則表現(xiàn)為G1峰和G2峰可以完全分開，但離心得到的懸浮液中完整細(xì)胞核少于不離心得到的。

從提高試驗(yàn)效率和節(jié)約試驗(yàn)成本來說，應(yīng)采用不離心的方法制備馬鈴薯單細(xì)胞懸浮液。

圖2 不同離心次數(shù)制備二倍體馬鈴薯品系‘E’的相對DNA含量直方圖和散點(diǎn)圖Figure 2 Peak value histogram and scatter diagram for relative DNA contents using different centrifugation times in diploid potato line'E'

2.3 不同染料的效果比較

取二倍體馬鈴薯品系‘E’組培苗新鮮幼嫩葉片制備的單細(xì)胞核懸浮液，分別用PI（50 μg/mL）染料和DAPI（5 μg/mL）染料進(jìn)行染色試驗(yàn)，檢測結(jié)果如圖3所示。PI染料和DAPI染料對馬鈴薯單細(xì)胞核懸浮液的制備無明顯差異，處理后得到的完整細(xì)胞核均較多，粒子團(tuán)清晰集中，背景碎片少，2個(gè)峰可以完全分開。

2.4 馬鈴薯品種‘青薯9號’的倍性分析

圖3 不同染料制備二倍體馬鈴薯品系‘E’幼葉的相對DNA含量直方圖和散點(diǎn)圖Figure 3 Peak value histogram and scatter diagram for relative DNA contents using different fluorescent dyes in diploid potato line'E'

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測二倍體馬鈴薯品系‘E’（a）和四倍體品種‘青薯9號’（b）的相對DNA含量Figure 4 Peak value histogram for relative DNA contents of diploid potato line'E'(a)and tetraploid variety'Qingshu 9'(b)by flow cytometry

利用以上所得的最優(yōu)試驗(yàn)方案，取大約20 mg正常生長3周左右的‘青薯9號’組培苗幼嫩葉片，置于預(yù)冷的培養(yǎng)皿中央，加入1 mL預(yù)冷的核分離緩沖液LB01，然后用鋒利的雙面刀片迅速切碎，將勻漿混勻，隨后用預(yù)先浸泡在解離液LB01中的400目濾膜將勻漿過濾到1.5 mL離心管中。加入10 μL預(yù)冷的質(zhì)量濃度為50 μg/mL PI的染料，同時(shí)加入質(zhì)量濃度為50 μg/mL的RNase，避光染色30～60 min，最后流式細(xì)胞儀上樣檢測。以二倍體馬鈴薯品系‘E’作為對照，將‘青薯9號’的核DNA含量與二倍體馬鈴薯‘E’相比較，結(jié)果如圖4。二倍體馬鈴薯‘E’的細(xì)胞核熒光強(qiáng)度在200道附近有明顯的峰，而‘青薯9號’在400道附近出現(xiàn)明顯的峰，為二倍體馬鈴薯‘E’的2倍，符合四倍體核DNA的特征。以上建立的方法適合進(jìn)行馬鈴薯的倍性分析。

3 討 論

在利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定染色體倍性的試驗(yàn)中，由于只利用物理方法切碎葉片，很難獲得大量的完整的細(xì)胞核。因此，還需要加入核分離緩沖液[20]。但是，對于不同科、屬和種的植物來說，在提取單細(xì)胞核懸浮液時(shí)，需要的解離液也是不同的。如果解離液不適合，會加速細(xì)胞核破裂，導(dǎo)致碎片增多。因此，選擇適合本試驗(yàn)材料的解離液尤為重要。例如，楊靜等[9]利用MgSO4緩沖液成功鑒定了桑樹的染色體倍性；馬艷芝和客紹英[10]利用LB01解離液成功鑒定了菘藍(lán)的染色體倍性；在本文中，利用3種核分離緩沖液制備馬鈴薯幼嫩葉片的單細(xì)胞核懸浮液，結(jié)果表明，解離液LB01的效果最好，所得到的單細(xì)胞核懸浮液中，有較多的完整細(xì)胞核，而且背景碎片較少，峰圖清晰。另外，LB01緩沖液也適應(yīng)于蘋果的染色體倍性鑒定[5]。所以，在利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定馬鈴薯染色體倍性時(shí)，選擇LB01緩沖液來制備核懸浮液。

由于植物的組織結(jié)構(gòu)不同，會采用不同的離心次數(shù)。于紅梅等[11]采用離心2次和離心3次的方法處理草莓單細(xì)胞核懸浮液，發(fā)現(xiàn)兩者相比，離心3次的效果更好，碎片較少，流式直方圖更清晰，還可以減少對儀器的堵塞。楊靜等[9]比較了不離心、離心1次、離心2次對桑樹染色體倍性鑒定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)3種離心方式對結(jié)果并無顯著影響，認(rèn)為采用不離心的方法制備桑樹的單細(xì)胞懸浮液，既可以提高試驗(yàn)效率又可以簡化試驗(yàn)操作步驟。吳雅琴等[13]利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定甜櫻桃砧木細(xì)胞核DNA含量和染色體倍性的試驗(yàn)中，采用不離心的方式處理甜櫻桃砧木單細(xì)胞核懸浮液，效果顯著，鑒定出了不同砧木品種的倍性。朱道圩等[21]則發(fā)現(xiàn)離心2次對中華獼猴桃染色體倍性鑒定效果好。本文比較了不離心和離心1次對馬鈴薯葉片單細(xì)胞核懸浮液制備效果的影響，發(fā)現(xiàn)離心之后，雖然粒子團(tuán)也清晰集中，但目的細(xì)胞略少于不離心組，可能是離心過程中丟失了部分目的細(xì)胞。故選擇不離心的方式制備馬鈴薯葉片單細(xì)胞核懸浮液。PI染料不僅可以與DNA結(jié)合而且還能與RNA結(jié)合，所以用PI進(jìn)行染色的時(shí)候要同時(shí)加入RNase。而DAPI僅與DNA結(jié)構(gòu)中的A-T區(qū)域結(jié)合，與RNA沒有結(jié)合位點(diǎn)。從試驗(yàn)結(jié)果來看，2種染料的效果差異不大，所以今后的的試驗(yàn)既可以選擇PI又可以選擇DAPI作為熒光染料。

在本試驗(yàn)中，通過對馬鈴薯幼嫩葉片的不同處理與結(jié)果分析，總結(jié)出一套利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定馬鈴薯染色體倍性的方案：取大約20 mg正常生長3周左右的馬鈴薯組培苗幼嫩葉片，置于預(yù)冷的培養(yǎng)皿中央，加入1 mL預(yù)冷的核分離緩沖液LB01，用鋒利的雙面刀片迅速切碎，然后將勻漿混勻，用預(yù)先浸泡在解離液LB01中的400目濾膜將勻漿過濾到1.5 mL離心管中。加入10 μL預(yù)冷的PI（50 μg/mL）染料，同時(shí)加入RNase（50 μg/mL），避光染色30～60 min，最后流式細(xì)胞儀上樣檢測。

采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定馬鈴薯染色體倍性，所需材料用量少，速度快，短時(shí)間內(nèi)便可鑒定出植株倍性，可以為馬鈴薯的倍性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。