HPLC同時(shí)測(cè)定茵梔黃顆粒中4種黃酮類成分

劉金宇，李艷芳,2，范建偉,2，劉武占,2

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006)

茵梔黃顆粒是由茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味中藥提取物制成的常用中成藥制劑，經(jīng)“6912”注射液沿革而來(lái)[1]；具清熱解毒，利濕退黃之功效，用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見面目悉黃、胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃赤，急、慢性肝炎見上述證候者[2]；臨床上對(duì)新生兒生理性和病理性黃疸具有比較好的療效[3-5]。

黃芩提取物具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、抗癌等藥理作用，現(xiàn)代研究表明黃芩提取物的主要藥效物質(zhì)是其中含有的黃芩苷、野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分[6-9]?！吨袊?guó)藥典》2015年版中黃芩提取物是茵梔黃顆粒處方的主要組成部分(占60.25%)，因此僅僅控制黃芩苷的含量難以保證黃芩提取物及制劑的質(zhì)量。本課題組前期曾對(duì)茵梔黃顆粒中環(huán)烯醚萜苷類成分同時(shí)測(cè)定[10]，為進(jìn)一步深入研究茵梔黃顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格控制其質(zhì)量，本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定茵梔黃顆粒中4種黃酮類成分野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量。

1 儀器與材料

安捷倫1100高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司，OpenLAB CDS工作站；AG285型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。對(duì)照品野黃芩苷(批號(hào)：110842-200403)、黃芩苷(批號(hào)：110715-200514)、漢黃芩苷(批號(hào)：112002-201702)、黃芩素(批號(hào)：111595-200905)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，均為含量測(cè)定用；對(duì)照品漢黃芩素(批號(hào)：MUST-14110311)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)。茵梔黃顆粒由魯南厚普制藥有限公司提供(批號(hào)：00917229、00917230、00917231、00917232、00917233、00917234，3 g/袋)；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇和磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～15 min，5%～6%A；15～23 min，6%～10%A；23～42 min，10%～20%A；42～60 min，20%～25%A；60～90 min，25%～60%A；)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取野黃芩苷對(duì)照品、漢黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、漢黃芩素對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各儲(chǔ)備液適量，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得含野黃芩苷34.98 mg·L-1、漢黃芩苷53.19 mg·L-1、黃芩素70.92 mg·L-1、漢黃芩素9.6 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取茵梔黃顆粒，研細(xì)，精密稱取1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 50%甲醇，密塞，稱定重量，超聲30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定重量，50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按茵梔黃顆粒處方比例及制備工藝制備缺黃芩提取物的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性 分別取上述3種溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，色譜圖見圖1。由圖可知，各待測(cè)成分色譜峰分離度均大于1.5；陰性樣品色譜中，在與野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾。

1.野黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素圖1 HPLC色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，經(jīng)計(jì)算得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)r及線性范圍。

結(jié)果分別為：野黃芩苷Y=5×106X-24 467，r=1.000，線性范圍0.070 0～0.349 8 μg；漢黃芩苷Y=1×107X-17 371，r=1.000，線性范圍0.106 4～0.531 9 μg；黃芩素Y=1×107X-140 218，r=0.999 9，線性范圍0.141 8～0.709 2 μg；漢黃芩素Y=1×107X-11 383，r=0.999 9，線性范圍0.019 2～0.096 0 μg。

2.7 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各待測(cè)組分峰面積RSD分別為野黃芩苷0.55%、漢黃芩苷0.44%、黃芩素0.89%和漢黃芩素0.75%，顯示儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取茵梔黃顆粒(批號(hào)：00917234)，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備一份供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、16、24 h，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果各待測(cè)組分峰面積的RSD分別為野黃芩苷0.98%、漢黃芩苷1.41%、黃芩素1.33%和漢黃芩素1.22%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取茵梔黃顆粒(批號(hào)：00917234)，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按上述液相色譜條件測(cè)定分析。測(cè)得平均含有量為野黃芩苷0.548 2 mg·g-1、漢黃芩苷0.756 5 mg·g-1、黃芩素1.482 mg·g-1、漢黃芩素0.179 0 mg·g-1，RSD分別為1.00%、0.65%、1.12%、1.36%，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的茵梔黃顆粒(批號(hào)：00917234)，研細(xì)，精密稱取6份，每份0.5 g，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，按本試驗(yàn)供試品溶液制備及測(cè)定方法進(jìn)行分析，具體結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.11 樣品含有量測(cè)定 取6批茵梔黃顆粒適量，按本試驗(yàn)方法制備供試品溶液，并測(cè)定分析。具體結(jié)果見表2。

表2 含有量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg·g-1)

3 討論

《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定茵梔黃顆粒(3 g/袋)含有黃芩苷180～220 mg[2]，即60.0～73.3 mg·g-1，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)野黃芩苷等4種成分總和僅在3.0 mg·g-1左右，說(shuō)明黃芩苷與野黃芩苷等4種成分含有量差異較大，在同一條件下同時(shí)檢測(cè)黃芩苷與野黃芩苷等4種成分的含有量，會(huì)產(chǎn)生較大的誤差。因此本試驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定茵梔黃顆粒中4種黃酮類成分野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含有量，未將黃芩苷同時(shí)測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示各待測(cè)成分含有量批次間差異較小，4種成分含有量總和在2.868～2.949 mg·g-1范圍內(nèi)，比較穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步控制茵梔黃顆粒的質(zhì)量。

以野黃芩苷等4種成分為指標(biāo)，考察了超聲、水浴提取兩種提取方法，結(jié)果兩種提取方法提取效率相差較小，最終選用了較方便的超聲提取方法。另外經(jīng)查閱文獻(xiàn)黃酮類成分檢測(cè)波長(zhǎng)為280[11]、278[12]、275[13-14]、274 nm[15-16]等，本試驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)樣品全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在274 nm下，野黃芩苷峰前面的干擾峰降至最低，對(duì)其含量測(cè)定無(wú)影響；其他3個(gè)成分亦均有較大吸收，且分離度均大于1.5，因此選取274 nm作為吸收波長(zhǎng)。