分級(jí)醇沉對(duì)羅勒多糖體外抑菌及免疫活性的影響

王 萍，賈曉順，朱慶均，張穎穎

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355)

羅勒具有疏風(fēng)解表、強(qiáng)心安神、散瘀止痛、行氣活血、解毒消腫等功效，臨床用于治療感冒咳嗽、頭痛發(fā)熱、月經(jīng)不調(diào)等[1-7]。課題組多年來以羅勒多糖為主要研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)羅勒多糖具有較好的抗腫瘤[8-10]和抗菌效果[11]。在此基礎(chǔ)上，課題組提取了羅勒粗多糖，再分級(jí)醇沉得到30%、50%、80%醇沉多糖，并對(duì)其體外抗菌及免疫活性進(jìn)行了初步檢測(cè)。結(jié)果顯示，不同濃度的醇沉羅勒多糖的體外抗菌及免疫活性有顯著差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料與試劑 羅勒，山東中魯醫(yī)院，經(jīng)山東中魯醫(yī)院藥劑科鑒定，為唇形科植物羅勒的干燥全草；無水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；胰蛋白酶，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，170512；苯酚，上海化工有限公司；濃硫酸，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；葡萄糖，AR，105℃干燥至恒重；營養(yǎng)瓊脂，杭州百思生物公司，20160325001；MH(B)肉湯，杭州百思生物公司，20150922001等。

1.1.2儀器與設(shè)備 HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海邦西儀器科技有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵，上海滬析；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；721G紫外可見分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；DF-101S磁力攪拌器，上海邦西儀器科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TD5Z平板離心機(jī)，上海顏麒生物科技有限公司；QQ-80B-III二氧化碳培養(yǎng)箱，上海啟前電子科技有限公司等。

1.1.3菌株及細(xì)胞株 藤黃微球菌ATCC10240、表皮葡萄球菌ATCC12228、普通變形桿菌ATCC49027、肺炎克雷伯菌ATCC13882、銅綠假單胞菌ATCC27853及臨床分離MRSA，均由山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供。RAW264.7巨噬細(xì)胞，由山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室保存，經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)至狀態(tài)穩(wěn)定后備用。

1.2 方法

1.2.1羅勒多糖的制備

(1)羅勒多糖的提?。簩⒘_勒藥材經(jīng)80%乙醇浸泡后充分干燥。取干燥后羅勒藥材200g，加水2L，回流提取3次，每次1.5h，分次收集濾液，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為 1.06。加無水乙醇調(diào)整乙醇濃度至80%，4℃靜置24h，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮依次洗滌，冷凍真空干燥，得羅勒粗多糖。將羅勒粗多糖加蒸餾水充分溶解后，再進(jìn)行2次醇沉，得3次醇沉多糖。參照文獻(xiàn)[12]，用Sevage法去除蛋白，最終得到去蛋白精制多糖。

(2)羅勒多糖分級(jí)醇沉：將去蛋白精制羅勒多糖加入25倍量蒸餾水使其充分溶解，加入無水乙醇，使醇濃度為30%，4℃靜置24h，離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，真空冷凍干燥得到30%醇沉多糖。同法分別制備50%、80%醇沉多糖。將醇沉多糖干燥后稱重，收率分別為40.3%、27.3%、24.26%。用苯酚硫酸法[13]測(cè)得30%、50%、80%醇沉多糖含量分別為27.50%、36.78%、19.11%。

1.2.2體外抗菌實(shí)驗(yàn)

(1)細(xì)菌培養(yǎng)基制備及菌種活化：營養(yǎng)瓊脂和MH(B)肉湯均按說明書要求高壓滅菌，營養(yǎng)瓊脂制作平板，MH(B)肉湯滅菌分裝后4℃保存?zhèn)溆?。將待檢測(cè)各菌接種于營養(yǎng)瓊脂表面，37℃培養(yǎng)24h，以無菌生理鹽水洗脫菌苔制備菌液，比濁法調(diào)整濃度為1×106cfu/mL。(2)MIC及MBC測(cè)定：將各醇沉多糖配制為25mg/mL濃度，0.22μm無菌過濾器過濾后備用。待檢測(cè)抑菌實(shí)驗(yàn)步驟參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)[14]，采用微量稀釋法進(jìn)行。按文獻(xiàn)進(jìn)行稀釋[11]，得到2～64倍藥物稀釋度。同時(shí)設(shè)立慶大霉素孔為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照孔僅加入菌液和培養(yǎng)液。加樣完畢后加入對(duì)應(yīng)菌液，每個(gè)藥物重復(fù)3孔，37℃培養(yǎng)24h，以酶標(biāo)儀對(duì)培養(yǎng)板在630 nm波長下測(cè)定 OD值，結(jié)合細(xì)菌生長情況判斷結(jié)果。從上述各MIC孔中，吸取10μL液體，無菌操作均勻涂布于營養(yǎng)

瓊脂平板上，以37℃ 24h后無明顯生長現(xiàn)象的濃度作為最低殺菌濃度(MBC)[15]。

1.2.3體外免疫活性檢測(cè)

(1)脾臟細(xì)胞增殖試驗(yàn)：采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。依文獻(xiàn)方法制備小鼠脾臟細(xì)胞懸液[16]，調(diào)整其濃度為1.0×106個(gè)/mL備用。按照表1分組進(jìn)行藥物干預(yù)。取按上述步驟制備得到的脾臟淋巴細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)/mL，每孔100μL細(xì)胞，并加入1 640培養(yǎng)液(10%FBS、1%青鏈霉素)的調(diào)整藥物濃度(表2)，空白對(duì)照組加入同體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)體系最終體積為200μL。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育44h，加入20μL MTT(5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，平板離心機(jī)離心2 000r/min 10min，棄上清液，每孔加入150μL DMSO，37℃振蕩10min，于酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定OD值。

(2)巨噬細(xì)胞增殖試驗(yàn)：RAW264.7巨噬細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FBS、1%青鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，待其狀態(tài)穩(wěn)定后備用。在96孔板中，每孔加入1×105的RAW264.7細(xì)胞，以上述RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整藥物濃度(表3)，最終體積為每孔200μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，只加入PBS和RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FBS、1%青鏈霉素)。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)44h后，加入20μL 5mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，隨后吸棄上清，每孔加入DMSO 150μL，37℃震蕩10min，以492 nm測(cè)定OD值。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌試驗(yàn)

表1顯示，除銅綠假單胞菌外，不同濃度的醇沉羅勒多糖均有一定的抑菌效果，其MIC在1.56～12.5mg/mL之間。各檢測(cè)菌中，羅勒多糖對(duì)藤黃微球菌ATCC10240和普通變形桿菌ATCC49027的抑菌效果最為顯著，30%醇沉羅勒多糖MIC為1.56mg/mL；各濃度醇沉多糖中，30%醇沉多糖顯示了較好的抑菌活性，對(duì)藤黃微球菌ATCC10240、糞腸球菌ATCC29212、表皮葡萄球菌ATCC12228和普通變形桿菌ATCC49027的抑制作用均強(qiáng)于其他濃度的醇沉羅勒多糖，50%醇沉羅勒多糖的抑菌活性又高于80%醇沉羅勒多糖。總體分析顯示，各濃度醇沉羅勒多糖對(duì)藤黃微球菌ATCC10240和普通變形桿菌ATCC49027的抑制效果最好，30%醇沉多糖的抑菌活性最強(qiáng)，80%醇沉羅勒多糖最弱。結(jié)果還表明，不同濃度的醇沉羅勒多糖對(duì)各菌株均無明顯的MBC，說明羅勒多糖不能殺死上述各菌，僅抑制其生長，故未測(cè)得MBC。

表1 不同濃度醇沉羅勒多糖MIC/MBC

注：“-”未測(cè)得明顯的MIC或MBC

3.2 脾臟細(xì)胞增殖試驗(yàn)

由表2可見，不同濃度的醇沉羅勒多糖對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞均有一定的刺激作用。最佳刺激濃度30%醇沉羅勒多糖為1mg/mL，50%醇沉羅勒多糖為0.25mg/mL，而80%醇沉羅勒多糖為0.125mg/mL。其中，50%醇沉羅勒多糖在0.063～0.5mg/mL濃度之間OD值均高于其他各組，顯示其在低濃度下依然具有較好促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖的作用。

表2 不同濃度醇沉羅勒多糖脾臟細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

注：*與空白對(duì)照相比，P<0.05；* *與空白對(duì)照相比，P<0.01；△與30%醇沉羅勒多糖相比，P<0.05；▲與80%醇沉羅勒多糖相比，P<0.05

3.3 脾臟細(xì)胞增殖試驗(yàn)

表3結(jié)果說明，不同濃度的醇沉羅勒多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞均有一定的刺激作用。最佳刺激濃度均為1mg/mL。其中，30%醇沉羅勒多糖在0.063～0.5mg/mL濃度下OD值均高于其他各組，在此濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的增殖具有最好的刺激作用。

4 討論

多糖是植物的主要活性成分之一[17]，水提分級(jí)醇沉是研究多糖的常用方法[18]。研究顯示，不同分子量的多糖具有不同的生物活性[19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，羅勒多糖具有抗腫瘤[20-22]、抗菌[11]等多方面功效，是羅勒的主要有效成分之一。

表3 不同濃度醇沉羅勒多糖巨噬細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

注：*與空白對(duì)照相比，P<0.05；* *與空白對(duì)照相比，P<0.01；△與30%醇沉羅勒多糖相比，P<0.05；▲與80%醇沉羅勒多糖相比，P<0.05

課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，水提醇沉是提取羅勒多糖的有效方法[23]。本文對(duì)不同濃度分級(jí)醇沉羅勒多糖的抑菌活性、刺激免疫細(xì)胞增殖能力進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)30%醇沉多糖抑菌效果最佳，50%醇沉多糖促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖作用最為顯著，而30%醇沉多糖對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的刺激作用最強(qiáng)。不同濃度的醇沉羅勒多糖作用效果有顯著差異，說明不同分子量的羅勒多糖具有不同的生物活性。據(jù)此推測(cè)，羅勒多糖中的大分子成分可能具有相對(duì)較好的抑菌活性，對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖也有較好的促進(jìn)；但在刺激脾臟細(xì)胞方面，羅勒多糖所含中等大小成分可能有更好的效果。

羅勒的食用價(jià)值較高，已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)。本研究顯示，不同濃度的醇沉羅勒多糖均有較好的抑菌和免疫調(diào)節(jié)活性。在此基礎(chǔ)上，課題組將進(jìn)一步提取純化羅勒多糖，以期明確其不同成分的具體作用，深入探究羅勒多糖的食用價(jià)值及藥用價(jià)值，進(jìn)而改進(jìn)食品生產(chǎn)工藝，為開發(fā)新型功能食品提供更多科學(xué)依據(jù)。◇