生殖器皰疹患者NK細(xì)胞、sHLA-G、IFN-γ和炎癥因子水平觀察及其臨床意義研究

曹獻(xiàn)芹 郭珊 李冰

近年來，生殖器皰疹的發(fā)生率明顯上升，流行病學(xué)研究提示，生殖器皰疹的發(fā)病率平均維持在636～584/萬人[1]。臨床上生殖器皰疹的發(fā)生能夠?qū)е律车鲤つど掀ぜ案刂芙M織的損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。

在探討生殖器皰疹感染機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，免疫功能紊亂或炎癥損傷，均可能提高生殖器皰疹的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致生殖道黏膜組織損害程度的增加[3]。自然殺傷（NK）細(xì)胞數(shù)量的上調(diào)，能夠維持患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞的免疫活性，提高其對(duì)病原體的吞噬和清除作用；γ 干擾素（IFN-γ）是調(diào)控自身淋巴細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)，IFN-γ 的上升能夠提高患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能的上升[4]；可溶性人類白細(xì)胞抗原G（sHLA-G）是重要的趨化因子，sHLA-G 的上升能夠通過激活體內(nèi)的趨化因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞對(duì)生殖道黏膜的浸潤(rùn)，進(jìn)而促進(jìn)病情的進(jìn)展[5]。為了揭示NK 細(xì)胞數(shù)量變化，sHLA-G、IFN-γ 的表達(dá)與生殖器皰疹的關(guān)系，從而為臨床上病情評(píng)估或者早期血清學(xué)診斷提供參考，本次研究選取2016年10月～2017年8月在我院接受治療的生殖器皰疹患者為研究對(duì)象，探討不同指標(biāo)的表達(dá)情況及其診斷學(xué)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月～2017年8月在我院接受治療的生殖器皰疹患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②經(jīng)相關(guān)檢查確診為生殖器皰疹者[6]；③無其他免疫系統(tǒng)疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不愿參與本項(xiàng)研究者；②近期合并感染性疾病者。共納入40 例，男24 例，女16 例，年齡29～55歲，平均（42.65±3.19）歲，其中初次發(fā)病者30 例，復(fù)發(fā)者10 例。對(duì)照組納入排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②無嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；③近期未發(fā)生感染性疾病，共納入40 例，男20 例，女20 例，年齡25～58 歲，平均（42.71±4.02）歲。兩組研究對(duì)象年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本項(xiàng)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)評(píng)審?fù)ㄟ^，且所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 檢測(cè)方法NK細(xì)胞檢測(cè)：清晨采集空腹靜脈血，按照10 000r/min 的離心速度進(jìn)行分離，加入5ml 抗凝劑，加入淋巴細(xì)胞分離液，按照密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，ARMI 1640 溶液洗滌3 次。采用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法進(jìn)行CD40+淋巴細(xì)胞的檢測(cè)。相關(guān)標(biāo)記操作在5ml 抗凝管中進(jìn)行，100μl 全血與CD3-PE、CD16+、CD56-FITC 抗體室溫反應(yīng)25min，采用紅細(xì)胞裂解液optiLYse C 溶血素溶解紅細(xì)胞，PBS 液體洗滌3 遍，每次5min，生理鹽水重新懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。FACS calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，流式細(xì)胞抗體購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司。

采集患者入院后的靜脈血，離心后收集上清液，采用免疫發(fā)光法檢測(cè)sHLA-G、IFN-γ 水平，檢測(cè)儀器為美國(guó)Bio-Bad 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，配套試劑盒購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司；采用全自動(dòng)生化法檢測(cè)IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 值，配套試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物檢測(cè)公司。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)觀察兩組患者NK 細(xì)胞數(shù)量變化及sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平的差異，探討聯(lián)合檢測(cè)輔助診斷生殖器皰疹的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)錄入后，采用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)和計(jì)量資料分別采用例和均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組研究對(duì)象NK 細(xì)胞數(shù)量變化及sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者NK 細(xì)胞表達(dá)水平及sHLA-G、IFN-γ水平的比較觀察組患者NK 數(shù)量和IFN-γ 水平低于對(duì)照組，sHLA-G 水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者NK 細(xì)胞表達(dá)水平及sHLA-G、IFN-γ 水平的比較

2.2 初次發(fā)病和復(fù)發(fā)組患者NK 細(xì)胞數(shù)量變化及sHLA-G、IFN-γ水平的比較復(fù)發(fā)組患者NK 數(shù)量和IFN-γ水平低于初次發(fā)病組，sHLA-G 水平高于初次發(fā)病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 初次發(fā)病和復(fù)發(fā)組患者NK 數(shù)量變化及sHLA-G、IFN-γ 水平的比較

2.3 兩組研究對(duì)象炎癥因子水平的比較觀察組患者的IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者炎癥因子水平的比較（pg/ml）

2.4 初次發(fā)病和復(fù)發(fā)組患者炎癥因子水平的比較復(fù)發(fā)組患者的IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 水平均高于初次發(fā)病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 NK 細(xì)胞、sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平聯(lián)合檢測(cè)輔助診斷生殖器皰疹的價(jià)值NK 細(xì)胞、sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平聯(lián)合檢測(cè)對(duì)生殖器皰疹診斷的靈敏度和特異度高于單項(xiàng)檢測(cè)。 見表5。

表4 初次發(fā)病和復(fù)發(fā)組患者炎癥因子水平的比較（pg/ml）

表5 NK 細(xì)胞、sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平聯(lián)合檢測(cè)輔助診斷生殖器皰疹比較（%）

3 討論

單純皰疹病毒的感染能夠顯著提高生殖器皰疹的發(fā)生率，導(dǎo)致患者生殖器黏膜的損害甚至累及其他器官。特別是在具有T 淋巴細(xì)胞免疫功能抑制的患者中，生殖器皰疹的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，臨床轉(zhuǎn)歸更差。生殖器皰疹的發(fā)生不僅能夠?qū)е戮植科つw黏膜的損害，同時(shí)還能夠增加遠(yuǎn)期惡性上皮性惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]?，F(xiàn)階段臨床上主要通過抗病毒等方式治療生殖器皰疹，但治療后的病情緩解率仍然較低，遠(yuǎn)期的復(fù)發(fā)率仍較高[8]。臨床上生殖器皰疹治療后的總體有效率不足54%，治療后6 個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率卻超過15%以上[9]。為此本研究通過對(duì)血清學(xué)免疫功能指標(biāo)的分析，探討其輔助診斷生殖器皰疹價(jià)值。

NK 細(xì)胞是患者體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞的重要組成成分，能夠通過對(duì)于自身吞噬功能及病原體清除功能的調(diào)控，提高機(jī)體對(duì)于單純皰疹病毒的免疫能力。NK 下降導(dǎo)致的T 淋巴細(xì)胞功能缺陷，能夠?yàn)椴《救肭?、整合及擴(kuò)增等提供條件，從而促進(jìn)了生殖器皰疹黏膜上皮細(xì)胞的病變過程[10]；IFN-γ濃度的維持不僅能夠影響炎癥因子的分泌和釋放，同時(shí)還能夠提高樹突狀細(xì)胞的功能，提高樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能，提高下游CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞的活性，維持患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能；sHLA-G 是趨化因子家族成員，其羧基末端結(jié)構(gòu)上包含的多個(gè)可結(jié)合的脯氨酸結(jié)構(gòu)，能夠誘導(dǎo)下游補(bǔ)體成分或者炎癥因子如腫瘤壞死因子的上調(diào)，增加生殖器黏膜的炎癥性損傷程度[11]。部分研究者揭示了NK 細(xì)胞在生殖器皰疹患者中的數(shù)量變化，認(rèn)為NK 細(xì)胞數(shù)量的減少能夠促進(jìn)疾病的發(fā)生和臨床治療預(yù)后的惡化[12]。

在本次研究中，相關(guān)指標(biāo)的分析可見，NK 細(xì)胞的數(shù)量、IFN-γ 的表達(dá)水平在生殖器皰疹患者中明顯下降，低于對(duì)照組人群，差異較為明顯，提示了NK 細(xì)胞數(shù)量減少、IFN-γ 的表達(dá)缺失可能是促進(jìn)生殖器皰疹發(fā)生的原因之一，而sHLA-G 的表達(dá)濃度明顯上升，提示sHLA-G 誘導(dǎo)的趨化因子或者炎癥因子的富集可能在促進(jìn)生殖器皰疹的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用[13]。葛幫友等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，生殖器皰疹患者NK 細(xì)胞的數(shù)量可平均下降30%以上，特別是在病程較長(zhǎng)、生殖器黏膜損傷較為明顯的患者中，NK 細(xì)胞數(shù)量的下降更為明顯。在復(fù)發(fā)組患者中，NK 細(xì)胞及IFN-γ 的下降或者sHLA-G 的上升幅度更為明顯，提示了相關(guān)指標(biāo)可能在生殖器皰疹的復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，這主要由于NK 細(xì)胞、IFN-γ 的下降能夠?qū)е職埩舭捳畈《绢w粒DNA 的擴(kuò)增及再次激活，而sHLA-G 誘導(dǎo)的局部炎癥性微環(huán)境能夠促進(jìn)殘留單純皰疹病毒的擴(kuò)散等因素有關(guān)。同時(shí)作者通過回顧分析不同的文獻(xiàn)，考慮與下列幾個(gè)方面的病理改變有關(guān)[14，15]：①NK 細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞吞噬分解單純皰疹病毒顆粒的能力下降，皰疹病毒顆粒浸潤(rùn)導(dǎo)致黏膜上皮細(xì)胞的損傷程度明顯增加，從而促進(jìn)了疾病的復(fù)發(fā)；②sHLA-G誘導(dǎo)的下游炎癥性信號(hào)通路MAPK 的激活，顯著促進(jìn)了中性粒細(xì)胞對(duì)于生殖器黏膜的損傷過程，加劇了上皮細(xì)胞間質(zhì)的炎癥損傷，最終促進(jìn)疾病復(fù)發(fā)；③IFN-γ 的表達(dá)下降使得機(jī)體免疫功能下降，對(duì)病毒的殺滅不足，導(dǎo)致病毒載量的增加和病情的反復(fù)。IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 是體內(nèi)的炎癥性指標(biāo)，在病例組及復(fù)發(fā)性患者中，IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 的表達(dá)濃度均顯著上升，特別是復(fù)發(fā)組患者中的上升更為明顯，提示炎癥性反應(yīng)是促進(jìn)患者病情進(jìn)展和復(fù)發(fā)的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。而最后診斷學(xué)方面的研究可見，NK 細(xì)胞、sHLA-G、IFN-γ 等在單獨(dú)輔助診斷生殖器皰疹方面均具有一定的價(jià)值，而聯(lián)合不同指標(biāo)后可以進(jìn)一步提高靈敏度。

綜上所述，生殖器皰疹患者的NK 細(xì)胞數(shù)量和IFN-γ 水平較低，sHLA-G 和炎癥因子水平較高，可在結(jié)合臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，輔助用于疾病診斷。