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    P17-BMP2聯(lián)合成骨誘導(dǎo)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

    2019-03-04 02:59:30李佳濱薛鋼寧尚波戴辛鵬王晗
    關(guān)鍵詞:磷酸酶充質(zhì)成骨

    李佳濱 薛鋼 寧尚波 戴辛鵬 王晗

    近些年來(lái),隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展,對(duì)心血管疾病治療方法的研究也日漸深入。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞對(duì)修復(fù)損傷心肌細(xì)胞起到積極促進(jìn)意義并逐漸成為潛在治療方法[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓內(nèi)的成體干細(xì)胞,具備多種生物學(xué)特性,P17-BMP2 是BMP2 的核心功能區(qū)氨基酸序列合成的一條存在17 個(gè)核苷酸的寡肽BMP2,合成便捷,操作簡(jiǎn)單,具有調(diào)控成骨方向分化、骨誘導(dǎo)性的作用[2]。本研究據(jù)此探討P17-BMP2 聯(lián)合成骨誘導(dǎo)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料選取3 周齡Wistar 雄性大鼠9 只(由上海第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SYXK2012-0001),體質(zhì)量60~70g;P17-BMP2 由清華大學(xué)合成提供;美國(guó)HyClone 公司生產(chǎn)的胰蛋白酶、DMEM-HG 及DMEM-LG 培養(yǎng)基;美國(guó)Gibca 生產(chǎn)的青霉素、特級(jí)胎牛血清、鏈霉素;美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)的β-甘油磷酸二鈉、地塞米松、抗壞血酸;美國(guó)Invitrogen 公司生產(chǎn)的Trizol;日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)的CCK-8 試劑;日本IX70 公司生產(chǎn)的熒光顯微鏡;美國(guó)DU-800 公司生產(chǎn)的核酸蛋白分析儀;美國(guó)MX3000P 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR 分析儀;美國(guó)Beckman 公司生產(chǎn)的高速冰凍離心機(jī)。

    1.2 培養(yǎng)方法將9 只大鼠脫頸處死,經(jīng)75%乙醇浸泡消毒5min,無(wú)菌環(huán)境下,將雙側(cè)脛骨、股骨取出,剪除骨端,以止血鉗壓碎,取含有20%胎牛血清、100mg/ml 青霉素、100mg/ml 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基,對(duì)骨髓腔進(jìn)行沖洗,均勻分散骨髓細(xì)胞,使用吸管打勻,加入離心管,1 500r/min 離心5min,丟棄上清,適量DMEM 打勻,制作單細(xì)胞懸液,取1ml 懸液置入25ml 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),放置37℃、5%CO2孵育箱內(nèi),48h 后換液,隨后每72h 換液。待細(xì)胞匯合成80%~90%單層后,取0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代,繼續(xù)培養(yǎng),取第3 代的細(xì)胞備用。隨后分成兩組進(jìn)行培養(yǎng),即A 組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)(含地塞米松7~10mg/L、維生素C 10mg/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)),B 組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)+P17-BMP2(成骨誘導(dǎo)液+P17-BMP2 10μg/ml培養(yǎng))。

    1.3 檢測(cè)方法第3 代細(xì)胞,經(jīng)BMSCs 離心稀釋,吹打成濃度1×104cells/ml 的均勻單細(xì)胞懸液,接種在96 孔培養(yǎng)板,每孔置入100μl 細(xì)胞懸液量,設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔、空白對(duì)照組(培養(yǎng)基100μl),孔板周圍加PBS 100μl,保持濕度。接種4 個(gè)96 孔板,置入CO2孵育箱培養(yǎng),24h 后換液,隨后每72h 換液,在培養(yǎng)第1、3、5、7 天取出,每孔加10μl CCK-8 試劑,繼續(xù)置入CO2孵育箱,孵育4h,酶聯(lián)免疫測(cè)定法檢測(cè)各組吸光光度值,取3 個(gè)孔的OD 平均值,波長(zhǎng)450nm。取3 只大鼠骨髓,反復(fù)3 次。

    取第3 代細(xì)胞,接種在24 孔培養(yǎng)板內(nèi),各組培養(yǎng)基培養(yǎng)7 天。PBS 洗滌,反復(fù)3 次,置入4℃固定液,流水沖洗后晾干。底物以二甲基甲酰胺溶解后,倒入緩沖液內(nèi),并加入固紫B 混勻;取工作液,置于37℃水溫箱內(nèi),靜置45min,流水沖洗;顯微鏡下觀察;取3 只大鼠骨髓,反復(fù)3 次。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR:按NCBI Cenebank 序列行引物設(shè)計(jì),開蓋前先進(jìn)行離心,置入DEPC 處理的ddH2O 稀釋,形成10nmol/μl 溶液,-20℃保存?zhèn)溆?。OPN 引物序列:上游引物5'-CATCAGAGCCACGAG TTTCA-3';下游引物5'-TCAGGGCCCAAAACACTA TC-3';OCN引物序列:上游引物5'-TGCCTTCTGTCT GGGTGTCC-3';下游引物5'-GCTGTGCCGTCCATACT TTCG-3';Runx2引物序列:上游引物5'-CAACATCTCC ACATCATTAG-3';下游引物5'-TTATTACCCTCTCA AACACTG-3';β-Actin 引物序列:上游引物5'-TGG AATCCTG TGGCATCCATGAAACTA-3';下游引物5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。在進(jìn)行7、14 天培養(yǎng)后,收集細(xì)胞,使用Trizol 一步法,對(duì)細(xì)胞內(nèi)總RNA 進(jìn)行提取。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,采取Q-PCR 反復(fù)檢測(cè)。取3 只大鼠骨髓,反復(fù)3 次。

    1.4 觀察指標(biāo)①分析堿性磷酸酶活性檢測(cè)值,堿性磷酸酶活性(金氏單位/100ml)=測(cè)定空OD 值/標(biāo)準(zhǔn)空OD 值×標(biāo)準(zhǔn)孔含酚量×2000 堿性磷酸酶的金氏單位;②熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征;③分析培養(yǎng)細(xì)胞后細(xì)胞增殖、mRNA 表達(dá)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 形態(tài)學(xué)特征在熒光顯微鏡下觀察,大鼠BMSCs接種后,24h 即會(huì)貼壁,48h 后見細(xì)胞貼壁,外觀呈纖維細(xì)胞樣,接種3~7 天后,細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng),增殖顯著,為單層生長(zhǎng)。B 組大鼠在培養(yǎng)5~7 天后,細(xì)胞為橢圓形或多角形,為無(wú)規(guī)則堆積;細(xì)胞在融合生長(zhǎng)期時(shí),直徑變短,形態(tài)呈扁平狀,細(xì)胞核及細(xì)胞核仁清晰,見圖1。

    2.2 兩組細(xì)胞增殖比較在培養(yǎng)細(xì)胞第1、3 天,A組、B 組BMSCs 細(xì)胞增殖程度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),培養(yǎng)第5、7 天后,B 組BMSCs 細(xì)胞增殖程度明顯高于A 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    圖1 原代培養(yǎng)5~7 天

    2.3 兩組mRNA 表達(dá)比較誘導(dǎo)第7、14 天,B 組OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表達(dá)均高于A 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    2.4 兩組堿性磷酸酶活性比較誘導(dǎo)第14 天,B 組堿性磷酸酶活性值為(1.32±0.10)U/L,高于A 組的(1.15±0.11)U/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.431,P=0.002)。

    表1 兩組細(xì)胞增殖測(cè)定OD 值比較

    表2 OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表達(dá)

    3 討論

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物特性較多,如可促進(jìn)血管生成,抑制細(xì)胞凋亡及免疫特性,并有抗纖維化、抗炎作用;同時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在多向分化能力,比如轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型;另外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有高增殖活性作用,成為理想的骨組織種子細(xì)胞[3]。

    BMP2 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一,屬于TGF-β超家族中的一員,與其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白相比,對(duì)成骨誘導(dǎo)活性的強(qiáng)度最高,可高度促進(jìn)骨形成及表達(dá),并能促使特異性骨細(xì)胞產(chǎn)物的分泌、生 成[4]。BMP2 信號(hào)傳導(dǎo)途徑是利用Smads 或MAPK兩條途徑,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Runx2 及Osx,進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性的基因表達(dá)。在成骨過程中,通過BMP2 刺激,使BMSCs 出現(xiàn)趨向、聚集、分化作用,以此形成軟骨及成骨。純天然BMP2 組成有114個(gè)氨基酸,但只有20 多個(gè)氨基酸真正發(fā)揮出骨誘導(dǎo)作用,組成核心結(jié)構(gòu)。尤其是在實(shí)際臨床操作中,難以獲得純天然BMP2,操作復(fù)雜,獲取困難,因此臨床加大了對(duì)基因重組BMP2 的研究。P17-BMP2 是由17 個(gè)氨基酸組成的寡肽BMP2,活性特點(diǎn)明顯,合成簡(jiǎn)單,通過細(xì)胞通訊及信息傳遞,可調(diào)控細(xì)胞成骨定向分化,具有骨誘導(dǎo)性;同時(shí)P17-BMP2 可使用多肽合成儀,在短期內(nèi)大量制備小分子多肽,可減輕基因工程技術(shù)操作復(fù)雜程度,價(jià)格成本低;另外小分子多肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,可充分暴露活性位點(diǎn),并輕易結(jié)合細(xì)胞受體,形成不同劑型的多肽,具有較高的生物活性與穩(wěn)定性。因此P17-BMP2 操作簡(jiǎn)單,活性明顯,具有較高的臨床使用價(jià)值。

    OPN、OCN 等是促進(jìn)骨形成的特異性骨細(xì)胞產(chǎn)物,BMP-2 信號(hào)可激活轉(zhuǎn)錄因子Runx2 及Osx,以此激活成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)。堿性磷酸酶廣泛存在于人體的肝臟、骨骼、腸等組織,屬一組同工酶,主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)第5、7 天后,B 組BMSCs細(xì)胞增殖程度明顯高于A 組,誘導(dǎo)第7、14 天,B 組OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表達(dá)均高于A 組,誘導(dǎo)第14 天,B 組堿性磷酸酶活性均高于A 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究提示,P17-BMP2 聯(lián)合成骨誘導(dǎo)有著促使骨生成,誘導(dǎo)成骨轉(zhuǎn)為軟骨的作用,誘發(fā)骨誘導(dǎo)活性。

    為了實(shí)現(xiàn)體外組織工程骨體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)的要求,需密切監(jiān)測(cè)組織相容性,骨體植入的功能狀態(tài)、愈合能力、再塑能力,觀察移植物的生物學(xué)功能、血管化程度等。為了確保異體植入物的準(zhǔn)確結(jié)果,需先排除正位植入物因受體骨、骨膜成骨導(dǎo)致的假陽(yáng)性。P17-BMP2 與成骨誘導(dǎo)能夠促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化,且P17-BMP2 與BMP2 相比,半衰期長(zhǎng),生物相容性高,適度降解性高,不影響B(tài)MP2 活性作用。

    綜上所述,P17-BMP2 聯(lián)合成骨誘導(dǎo)能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖以及成骨分化,P17-BMP2和成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合作用在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖,對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促分化作用明顯,具有較高的可研究性。

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