血小板濃縮物質(zhì)在脂肪液化創(chuàng)面治療中的研究進(jìn)展

（廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江，524000）

隨著肥胖人群及糖尿病患者人數(shù)的增加，術(shù)后傷口脂肪液化在臨床治療中有明顯增多趨勢。據(jù)國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，腹部術(shù)后切口脂肪液化的發(fā)生率約為8.20%。脂肪液化目前已成為普外科、婦產(chǎn)科、骨科的常見術(shù)后并發(fā)癥。吳階平，裘法祖等在《黃家駟外科學(xué)》[2]中就指出：切口發(fā)生脂肪液化后如經(jīng)久不愈則有利于細(xì)菌滋生導(dǎo)致感染，延長住院時(shí)間，加重患者心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在臨床診療中，傷口脂肪液化應(yīng)當(dāng)引起醫(yī)生的高度重視。然而我國對傷口脂肪液化的診治尚無臨床指南，目前常用治療方式有：清創(chuàng)負(fù)壓引流、光線治療、高滲糖胰島素治療、濕性輔料治療，血小板濃縮物質(zhì)治療，中藥中醫(yī)治療等幾大類[3]。血小濃縮物質(zhì)作為新型創(chuàng)面修復(fù)材料，因其制備方法簡便、成本低廉、具有較高的臨床實(shí)用性，所以本文將圍繞血小板濃縮物質(zhì)及其在脂肪液化創(chuàng)面治療領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期待為脂肪液化創(chuàng)面的治療帶來新的思路。

1、血小板濃縮物質(zhì)的發(fā)展

上世紀(jì)80年代，最初的血小板濃縮物質(zhì)在濃縮提取后，可釋放6-8倍生理計(jì)量生長因子[4-5]。在臨床中用于促進(jìn)外科手術(shù)的傷口及創(chuàng)面愈合。到上世紀(jì)90年代PRP的概念被提出，并由Whitman[9]和Marx[10]首先將其應(yīng)用于臨床治療。隨著PRP制備技術(shù)的提高，血小板濃縮純度得到了大幅提升，PRP中血小板濃度可達(dá)到95%以上。近年來PRP已廣泛應(yīng)用于頜面外科、神經(jīng)外科、骨科、整形美容外科等領(lǐng)域。但PRP的應(yīng)用有其局限性，PRP制備耗時(shí)長，在第二次離心轉(zhuǎn)移試劑時(shí)可能出現(xiàn)污染，制備時(shí)使用的抗凝劑、氯化鈣、血凝酶等制劑，在創(chuàng)面修復(fù)過程中可對細(xì)胞增殖過程及纖維蛋白凝集作用產(chǎn)生負(fù)面影響。21世紀(jì)初法國醫(yī)生Joseph Choukroun[11]及其團(tuán)隊(duì)提取出第二代血小板濃縮物質(zhì)PRF，又稱為Choukroun’s PRF，并應(yīng)用于臨床治療。與PRP對比，PRF制備只需一次離心、耗時(shí)短、無添加任何試劑，可長效刺激組織修復(fù)并能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，能夠覆蓋修復(fù)小范圍的組織缺損。

1. PRP及PRF的制備方法

2.1 PRP的制備及激活

取靜脈血于含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管中，第一次以低速900 r/min （100 × g，離心10 min）離心。由于血液中各成分比重不同，血漿、血小板、紅細(xì)胞可出現(xiàn)分層。下層為紅細(xì)胞層，中間層出現(xiàn)白色的薄層含有大量血小板和白細(xì)胞，上層為澄清淡黃色血漿層。取血漿和中間層進(jìn)行第二次離心，以高速3000 r/min （400 × g，離心10 min）離心后，根據(jù)密度不同分為 3 層：上層為貧血小板血漿（PPP，Platelet-poor Plasma）層，中間層即為PRP，下層為少量紅細(xì)胞，吸取中間層混勻即為 PRP，制備得到的PRP在抗凝狀態(tài)下一般可保存8小時(shí)[12-13]。應(yīng)用二次離心法制備 PRP需消耗大量血液，且容易污染，因此臨床制備PRP通常采用血液成分分離自動(dòng)化設(shè)備，在制備較大量PRP的同時(shí)，可將紅細(xì)胞和血漿回輸給患者。取制備好的PRP約5 ml，加入1ml激活劑(由1ml 10%的氯化鈣與1000 U凝血酶混合制成)，PRP激活后可迅速釋放α顆粒及致密顆粒，這兩種顆粒均可分泌大量生長因子。

2.2 PRF的制備

取靜脈血至無添加劑的玻璃試管內(nèi)，在血液凝固前應(yīng)盡快離心，以3000 r/min （400 × g，離心10 min）離心后，試管內(nèi)可見分為三層。上層為淡黃色PPP，中間層呈白色凝膠狀PRF，下層為紅細(xì)胞層。應(yīng)用此方法制備的PRF所釋放生長因子的量明顯多于其他制備方法[14]。PRF的制膜及保存：取出離心得到的PRF凝膠，因PRF層與紅細(xì)胞層交界處含有大量的血小板和白細(xì)胞，在去除紅細(xì)胞層時(shí)應(yīng)當(dāng)保留少量紅細(xì)胞層[15]。PRF凝膠在除去水分后即可得到PRF薄膜。制膜的方法很多，最常見方法有紗布擠壓法和金屬板重力壓制法。相比較兩種方法，金屬板壓制的PFR膜受力面均勻且可避免紗布上的纖維殘留在PRF膜中，因此金屬板重力壓制法效果更加穩(wěn)定可靠[16-17]。PRF可在短時(shí)間內(nèi)保存于低溫 4℃的條件下[18]，如需長期保存則可使用冷凍干燥處理技術(shù)[19]。

2.3 PRF的幾種亞類

隨著PRF的應(yīng)用推廣，在標(biāo)準(zhǔn)的PRF制備技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出L-PRF（leukocyte-PRF）、A-PRF (advanced platelet-rich fibrin)、i-PRF（Injectable Platelet-Rich Fibrin）、T-PRF(titanium-prepared， platelet-rich fibrin) 等幾種亞類。L-PRF在標(biāo)準(zhǔn)PRF制備方法基礎(chǔ)上，將轉(zhuǎn)速調(diào)至2700 r/min并離心12分鐘，可得到富含白細(xì)胞的L-PRF。因其富含炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子，可具有更好炎癥調(diào)節(jié)作用和抗菌效應(yīng)[20-21]。將血液置入無菌塑料管中，以1500 r/min轉(zhuǎn)速離心14分鐘，可得到凝膠遠(yuǎn)端富含中性粒細(xì)胞的A-PRF[22]，A-PRF更有利于促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，從而分泌生長因子促進(jìn)骨骼和軟組織再生。Xuzhu Wang等[23]于2017年率先提出i-PRF概念，將血液以700r/min低轉(zhuǎn)速離心3分鐘可得到一種呈液體狀的i-PRF，這是全新的PRF亞類。在與PRP的動(dòng)物對比實(shí)驗(yàn)中[24]，i-PRF因含有纖維蛋白和白細(xì)胞而更顯著動(dòng)員細(xì)胞遷移促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。應(yīng)用鈦合金離心管將血液在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心15分鐘可得到T-PRF[25-26]，T-PRF中的纖維蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，能夠在創(chuàng)面作用更長時(shí)間。且通過鈦合金激活的血小板比二氧化硅激活的血小板具有更好的生物相容性。見表1.

表1 PRF的幾種亞型的制備方法及特性

3.血小板濃縮物質(zhì)的作用機(jī)制：

3.1 血小板濃縮物質(zhì)可釋放大量生長因子

目前已知能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生長因子包括：血小板衍生因子(PDGF，Platelet-Derived Growth Factor)、表皮細(xì)胞生長因子（EGF，Epidermal Growth Factor）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF，F(xiàn)ibroblast Growth Factor）、胰島素樣生長因子（IGF，Insulin Growth Factor）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，Vascular Endothelial Growth Factor）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGFβ，Transforming Growth Factor-β）、肝細(xì)胞生長因子（HGF，Hepatocyte Growth Factor）等[27]。而血小板濃縮物質(zhì)可釋放的生長因子種類包括：PDGF、EGF、VEGF、FGF、IGF、TGF-β等，且這些生長因子按人體生物比例釋放可大大提高其利用率及生物效應(yīng)[28]。PDGF具有PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB 三種亞型，是創(chuàng)面形成時(shí)最早分泌的生長因子之一，并作用于創(chuàng)面修復(fù)全過程[29]。PDGF通過激活平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，可增加膠原蛋白細(xì)胞合成、激活纖維蛋白酶原、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、加快微血管網(wǎng)的重建及肉芽組織的形成[30-31]，此外PDGF還可促進(jìn)TGFβ、IGF-1的分泌[32]。EGF主要由血小板脫顆粒分泌，刺激上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移。VEGF是調(diào)節(jié)血管新生、淋巴管生成及血管通透性的關(guān)鍵調(diào)控因子[34]，對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)烈的旁分泌作用，加速創(chuàng)面肉芽中的血管生成[36-37]。FGF與VEGF具有協(xié)同效應(yīng)，通過刺激成纖維細(xì)胞增殖，增加膠原蛋白合成，加速肉芽組織的形成[39]。FGF還可促進(jìn)TGF-α的分泌，抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的局部分泌堆積，在促進(jìn)組織上皮化的同時(shí)可減少增生性瘢痕[40-41]。IGF對細(xì)胞有自分泌作用，主要作用于創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)階段，可加強(qiáng)成纖維細(xì)胞的分泌功能[43]。TGF-β也有三個(gè)不同亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，在創(chuàng)面愈合過程中它們幾乎同時(shí)出現(xiàn)，但作用卻各不相同。TGF-β1往往以較高濃度存在于創(chuàng)面中，具有炎癥細(xì)胞招募作用，可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬、清理功能[45]。TGF-β2幾乎參與創(chuàng)面愈合的所有階段，它通過對炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的招募作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成，形成新生肉芽組織[46-47]。TGF-β2通過調(diào)節(jié)增加I型和III型膠原蛋白分泌，促進(jìn)疤痕形成。與TGF-β1、TGF-β2促進(jìn)瘢痕生成不同，TGF-β3能減少膠原蛋白在組織中的堆積，抑制疤痕增生[48]。

3.2 PRF的空間結(jié)構(gòu)作用

傳統(tǒng)濃縮血小板及PRP缺少空間立體結(jié)構(gòu)，血小板短時(shí)間內(nèi)破裂釋放出α顆粒并迅速分泌生長因子，但這種生長因子釋放峰值呈一過性，隨后逐漸減少[49]，創(chuàng)面中血小板的壽命只有五天左右，因此難以長時(shí)間維持生長因子的有效濃度[50]。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)PRF中纖維蛋白、纖連蛋白和玻連蛋白成疏松立體結(jié)構(gòu)，血小板及白細(xì)胞可同時(shí)與數(shù)條纖維蛋白形成類似半橋粒連接結(jié)構(gòu)，使得血小板內(nèi)的α顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[51]。PRF纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與人類天然組織結(jié)構(gòu)相似，不僅可以延緩內(nèi)源性纖維蛋白酶降解從而保障血小板長效提供生長因子[52-53]，還可以作為物理結(jié)構(gòu)支架誘導(dǎo)組織細(xì)胞爬行與遷移，其疏松的結(jié)構(gòu)也有利于白細(xì)胞的滯納及氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)的彌散，更利于免疫細(xì)胞發(fā)揮抗感染作用[54]。

3.3 血小板濃縮物質(zhì)的抗菌作用

血小板分泌的抗菌蛋白質(zhì)包含至少四個(gè)家族：細(xì)胞因子源性肽、防御素、抗菌肽衍生物、蛋白水解衍生物[55]，血小板α顆粒分泌的抗微生物源性肽、細(xì)胞因子源性肽、免疫細(xì)胞趨化因子等具有免疫細(xì)胞招募效應(yīng)，通過招募巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等均可增強(qiáng)創(chuàng)面抗感染能力[56]。血小板的表面及胞內(nèi)還具有Toll 樣受體、細(xì)胞因子IL-1-TLR 受體家族等多種傳感器，并可通過模式識別受體(PRR，Pattern recognition receptor)快速應(yīng)答創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，在發(fā)揮凝血功能的同時(shí)可限制細(xì)菌擴(kuò)散，具有直接抗菌作用[57-58]。PRF中高濃度的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞在局部炎性和感染時(shí)釋放白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α等，可增強(qiáng)組織抗感染能力[59-60]。PRF中的白細(xì)胞和血小板，可持續(xù)釋放天然抗菌肽(HDP-Host Defense Peptides)，HDP介導(dǎo)的人體免疫反應(yīng)在發(fā)揮抗菌效應(yīng)的同時(shí)可減少細(xì)胞毒性，并克服細(xì)菌的耐藥性，且HDP對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及病毒和真菌均有抗菌活性[61-63]。

4.血小板濃縮物質(zhì)在脂肪液化創(chuàng)面的治療

4.1 脂肪液化的基本概念

術(shù)后切口脂肪液化是手術(shù)切口部位脂肪組織細(xì)胞受損破裂、壞死、液化的變化過程，其病理機(jī)制尚未完全明了，其病理表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞破裂后脂滴溢出、聚集、伴有無菌性炎癥反應(yīng)，脂肪液化過程雖無細(xì)菌感染，但延長了切口愈合的時(shí)間，增加了切口感染的機(jī)會(huì)。目前我國對脂肪液化切口沒有明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參考蘇明寶等[64]的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)生于手術(shù)后5-7天左右，多數(shù)患者切口出現(xiàn)較多滲液，于常規(guī)換藥檢查傷口時(shí)可見敷料上有淡黃色滲液，擠壓切口周圍皮下組織有較多滲液從切口溢出; ②切口愈合延遲，皮下組織游離，切口滲液中可見大量飄浮脂滴; ③切口及周圍皮膚無明顯紅腫壓痛，切口邊緣及皮下組織無感染及壞死征象; ④取傷口滲出液涂片，鏡下可見大量脂滴，連續(xù)3次培養(yǎng)無細(xì)菌生長。

4.2 脂肪液化的易患因素

術(shù)后切口脂肪液化的高危因素包括肥胖、高頻電刀使用不當(dāng)、糖尿病、手術(shù)切口保護(hù)欠妥、縫合方法和縫合技術(shù)經(jīng)驗(yàn)不足、營養(yǎng)素的缺乏等[65]。而切口脂肪液化的發(fā)生往往是以上多個(gè)因素綜合作用，造成切口局部血液循環(huán)差，血管再生速度減慢，組織修復(fù)障礙，從而導(dǎo)致局部脂肪細(xì)胞無菌性變性壞死，脂肪細(xì)胞破裂后脂滴溢出、聚集，伴有局部無菌性炎癥反應(yīng)發(fā)生。

4.3 脂肪液化創(chuàng)面的治療現(xiàn)況

患者術(shù)后切口出現(xiàn)脂肪液化時(shí)，早期清除壞死組織及滲液是處理的關(guān)鍵，通暢的引流出積液可以避免傷口的感染。目前對于術(shù)后切口脂肪液化治療的方法有： 創(chuàng)面局部拆線引流、中醫(yī)藥物外敷、光線照射療法、細(xì)胞生物因子、負(fù)壓創(chuàng)面療法 (NPWT，NegativePressure Wound Therapy)、高滲糖胰島素治療、濕性敷料療法、蝶形膠布牽拉等等。這些種類繁多的治療均需要價(jià)格昂貴的醫(yī)療設(shè)備或耗材，在臨床治療中增加了醫(yī)療成本及患者的費(fèi)用負(fù)擔(dān)。應(yīng)用血小板濃縮物質(zhì)治療脂肪液化切口，因取材均為患者本人血液，無嚴(yán)重醫(yī)學(xué)倫理問題，避免了機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，價(jià)格低廉、操作簡便安全，能明顯縮傷口愈合時(shí)間及較少患者平均住院時(shí)間，可有效減輕患者心理與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是治療手術(shù)切口脂肪液化的有效方法之一。據(jù)我國國內(nèi)參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表明，高娟等[66]應(yīng)用PRP治療婦產(chǎn)科手術(shù)后切口脂肪液化，使患者傷口平均愈合時(shí)間縮短42.06%。劉曉韜等[67]應(yīng)用PRP使胃腸外科、肝膽外科手術(shù)后切口脂肪液化的平均愈合時(shí)間縮短45.61%，且在治療期間均未有不良事件發(fā)生，治療過程安全性較高，具有極高的臨床實(shí)用性。

雖然目前尚無PRF應(yīng)用于臨床脂肪液化創(chuàng)面治療的相關(guān)報(bào)道，但目前已有離體脂肪組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)利用PRF能夠促進(jìn)脂肪干細(xì)胞（ASCs，Adipose-derived Stem Cells）的增殖與分化[68]，提高局部脂肪細(xì)胞和毛細(xì)血管的數(shù)量及密度，促進(jìn)脂肪組織局部的血管再生，減少脂肪細(xì)胞的凋亡，減少脂肪組織纖維壞死的發(fā)生，增加脂肪組織的質(zhì)量保持率[69]。在臨床應(yīng)用PRF的傷口治療中，可以觀察到PRF相對于傳統(tǒng)治療方法，可以提高傷口生長因子濃度、修復(fù)細(xì)胞過度凋亡的情況并促進(jìn)血管生成及組織修復(fù)，同時(shí)還具有抗感染的作用，從而加速傷口愈合、縮短治療周期[70]。PRF較PRP更易于獲取，制備方法更簡單，對于術(shù)后脂肪液化傷口治療具有巨大研究價(jià)值和實(shí)用潛力。