女貞子乙醇提取物對人毛囊無色素黑素細胞c-kit表達的影響

（1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院 皮膚科，河南 洛陽，471000；2.洛陽市第二中醫(yī)院皮膚科，河南 洛陽，471003）

白癜風是皮膚科常見多發(fā)難治性色素障礙性疾病，嚴重影響患者皮膚外觀美容，導致患者極大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟負擔。白癜風的病因和發(fā)病機制十分復雜，至今仍未明確[1]。目前西醫(yī)治療白癜風方法很多，如光化學療法，免疫療法、自體表皮移植及黑素細胞移植等[2]，但療效不理想或有一定副作用，存在著較大的局限性。相比之下，某些中藥制劑在白癜風治療方面已取得了令人滿意的效果 ，但具體作用機制研究較少。女貞子具有滋補肝腎，明目烏發(fā)的功能。藥理研究表明女貞子具有護肝、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老等作用[3]，還可上調(diào)酪氨酸酶活性，促進黑素合成。干細胞因子(SCF)及其受體c-kit對黑素細胞的分化、增殖、遷移具有重要作用。前期研究顯示，與正常對照組相比，白癜風皮損毛囊無色素黑素細胞（AMMC）上c-kit表達顯著減少，提示白癜風皮損毛囊SCF/c-kit信號通路可能存在異常受損從而致黑素細胞功能失調(diào)[4]。鑒于此，本研究旨在探討女貞子乙醇提取物對人毛囊無色素黑素細胞c-kit表達的影響，并以此為切入點，探討白癜風的治療新途徑。

1 試劑與材料

1.1 研究材料

皮膚標本取自人正常頭皮(河南科技大學第一附屬醫(yī)院急診外科提供)，4℃環(huán)境下以DMEM培養(yǎng)基貯存，貯存時間不超過48h。

1.2 主要研究試劑

兔抗人酪氨酸激酶受體抗體、B-actin抗體、鼠抗人T311酪氨酸酶單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(杭州吉諾)，中性蛋白分離酶(dispase)(廣州威佳)，M254培養(yǎng)基、人黑素細胞生長添加劑(HMGS)、Transwell培養(yǎng)板(美國Cascade)，即用型SP免疫組化試劑盒(福建邁新)，RNase(上海瑞齊)，瓊脂糖凝膠(上海艾研)，Trizol(美國Invitrogen公司)。

2 方 法

2.1 中藥提取

參照李永偉等[5]制定的方法。

2.2 毛囊無色素黑素細胞培養(yǎng)

參照王大光等[6]制定的方法進行。

2.3 細胞增殖

參照李永偉[7]方法，配制0，2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL含女貞子乙醇提取物濃度的TICVA培養(yǎng)基。無色素黑素細胞用dispase酶消化傳代后第2天加入所配培養(yǎng)基于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每個濃度設(shè)4個復孔，72 h后Coulter Counter計數(shù)，確定最佳濃度。然后加入現(xiàn)配XTY/PMS顯色液，490 nm波長下檢測各孔吸光度(A值)。

2.4 c-kit 表達

以每孔1×105個，將培養(yǎng)液接種于6孔培養(yǎng)板，37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，去除上清，加入女貞子提取物，培養(yǎng)72 h終止。同時設(shè)立空白對照組，僅添加M254完全培養(yǎng)基。設(shè)計PCR引物[8]，RT-PCR測定c-kit mRNA的相對表達量。

2.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS23.0軟件，采用重復測量方差分析或獨立樣本 檢驗， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 細胞增殖

重復測量方差分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，濃度為2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL女貞子乙醇提取物對毛囊無色素黑素細胞的增殖具有促進作用(F=9.34，P＜0.01)，其中0.22mg/mL促進作用最為顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度女貞子提取物對毛囊無色素黑素細胞的促增殖作用(n=10)

3.2 c-kit表達

對照組c-kit mRNA表達值為(0.125±0.023)，而0.22mg/mL組為(0.647±0.046)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(n=10， =-32.096，P＜0.001)。

4 討 論

祖國醫(yī)學認為，白癜風病因病機主要為“肝腎不足”，肝腎不足則“皮毛膝里失養(yǎng)而發(fā)白斑”，因此臨床多采用“補益肝腎”法治療。女貞子具有滋補肝腎，明目烏發(fā)的功能，其主要有效成分為酪醇和齊墩果酸，其中酪醇具有較強的抗氧化、抗疲勞、抗毒、抗微波輻射等護體強健功效，而齊墩果酸則可抗炎、抗病毒、抗氧化、抗突變、增強肌體免疫力。女貞子提取物可誘導黑素細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架的聚合，促進黑素細胞的黏附及遷移。

臨床觀察顯示，白癜風復色時多是先從白斑毛囊口出現(xiàn)色素沉著，漸向外周擴展，最后融合成片；表明白癜風復色主要是皮損區(qū)毛囊黑素細胞的增殖和遷移。近年來，通過對毛囊外毛根鞘無色素黑素細胞的解剖結(jié)構(gòu)、形態(tài)學、體外活化黏附和移行方面都進行研究，認為毛囊無色素黑素細胞位于外毛根鞘的中下段，形態(tài)類似于周邊的毛皮質(zhì)細胞，外觀胞體偏圓，樹突不明顯，數(shù)目較少，常成群集中分布，胞質(zhì)中充滿黑素體，多為Ⅱ、Ⅲ期黑素小體，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化導致功能上的不成熟。毛囊無色素黑素細胞是靜止狀態(tài)的黑素細胞，是表皮黑素細胞的干細胞和儲庫，能夠為特定因素所激活，分化增殖從無活性狀態(tài)慢慢成熟為有活性狀態(tài)并沿著外毛根鞘遷移到附近的表皮，形成色素島，在白癜風復色過程中有著極為重要的作用，而SCF/c-kit信號轉(zhuǎn)導途徑對黑素細胞的分化、增殖、遷移均具有關(guān)鍵作用[9]。

在本研究中，我們通過設(shè)置不同濃度的女貞子乙醇提取物，研究其對無色素黑素細胞的作用。結(jié)果顯示，不同濃度的女貞子提取物均可促進無色素黑素細胞的增殖。進一步進行RT-PCR測定c-kit mRNA的相對表達量顯示，與對照組相比較， 0.22mg/mL的女貞子提取物的c-kit mRNA的相對表達量具有顯著優(yōu)勢，為(0.647±0.046)。

我們前期研究顯示[10]，白癜風皮損毛囊AMMC上c-kit表達顯著減少，提示白癜風皮損毛囊SCF/c-kit信號通路可能存在異常受損從而致黑素細胞功能失調(diào)。而結(jié)合本次研究結(jié)果，我們認為女貞子乙醇提取物有可能是通過SCF/c-kit信號途徑激活毛囊外毛根鞘的無色素黑素細胞，使其分化增殖并遷移至表皮基底層而發(fā)揮治療白癜風的作用。