循環(huán)microRNA在骨折損傷中的研究進(jìn)展及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

高如陽 陳亮

骨折在死亡和人身傷害案（事）件的司法鑒定中常見，其被關(guān)注的焦點(diǎn)在于骨折的部位、時(shí)間以及性質(zhì)。[1]骨折是指骨結(jié)構(gòu)的連續(xù)性完全或部分?jǐn)嗔?。骨組織具備較強(qiáng)的再生能力，骨折后最終也可以達(dá)到完全愈合。骨折損傷的形成和修復(fù)與許多因素有關(guān)，這些因素是鑒定過程中需要考慮的問題；[2]而目前的鑒定主要根據(jù)X線影像學(xué)技術(shù)、CT及MRI技術(shù)，但其診斷的準(zhǔn)確性相當(dāng)程度上取決于鑒定人的診斷經(jīng)驗(yàn)，因此尋求一種更加精確的、客觀的鑒定新技術(shù)以提高對(duì)之鑒定的準(zhǔn)確性，便成為法醫(yī)鑒定工作的迫切需求。近年來，miRNA被視為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的“金礦”，國內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)表明miRNA與骨折的過程密切相關(guān)。[3]隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將循環(huán)miRNA應(yīng)用到司法鑒定過程中成為了可能。本文擬就循環(huán)miRNA在骨折損傷過程中的研究進(jìn)展及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用作以下闡釋。

一、循環(huán)miRNA簡介

miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控作用的RNA，最初在線蟲的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，[4]后來發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物、植物基因組中都有表達(dá)。[5]miRNAs基因的轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)，由RNA聚合酶II介導(dǎo)，最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為原始miRNAs（pri-miRNAs）；而 pri-miRNAs在 核 酸 酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被切割為約70個(gè)nt組成的前體microRNAs（pre-microRNAs），進(jìn)而在核質(zhì)／細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5的作用下，將pre-microRNAs輸送到細(xì)胞質(zhì)中，隨后又在核酸酶Dicer的作用下，被剪切成為大約22個(gè)nt長度的雙鏈miRNA分子；雙鏈miRNA分子進(jìn)入沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，只有其中成熟的miRNA分子留在復(fù)合體中；而成熟的microRNAs能夠結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)，經(jīng)過堿基配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)。[6]

“循環(huán)miRNA”是指在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在的miRNA分子，其具有取材方便、靈敏度高的特性。[7]研究數(shù)據(jù)顯示經(jīng)過反復(fù)凍融或室溫放置24小時(shí)的血漿樣品，其miRNA的含量與新鮮的血漿miRNA含量無顯著性差異。循環(huán)miRNA作為一種體液檢測的生物學(xué)標(biāo)記物，具有易于檢測、相對(duì)無創(chuàng)的特點(diǎn)。[8]由于miRNA的長度、組織特異性以及在擴(kuò)增中的相對(duì)穩(wěn)定性,循環(huán)miRNA展示出了巨大的應(yīng)用前景。[9]隨著研究進(jìn)展的不斷深入，大量數(shù)據(jù)表明，循環(huán)miRNA參與人體多種調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖和凋亡、多種腫瘤和疾病的發(fā)生發(fā)展、機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的功能等[10],是目前一種比較理想的生物學(xué)標(biāo)志物。[11]

二、循環(huán)microRNA在骨折損傷中的研究

骨折的愈合過程極其復(fù)雜，是分子層面、多種細(xì)胞、不同組織和各種器官間相互作用的結(jié)果，其具體包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化、血管生成和重建、骨痂的形成等，[12]再加之由于骨折的部位、時(shí)間、性質(zhì)不同，諸因素都給法醫(yī)鑒定工作帶來一定的難度。目前，已有部分研究發(fā)現(xiàn)與骨折部位相關(guān)的microRNA，但是尚未發(fā)現(xiàn)其與損傷時(shí)間的確切相關(guān)性。

（一）髖部骨折

隨著人們生活水平的不斷提高，人口老齡化[13]是我國目前一個(gè)重要的社會(huì)問題，成為威脅人類健康的重要因素。而髖部骨折，尤其是在老年女性中更容易發(fā)生，[14]再加上老年人的基礎(chǔ)疾病較多，因此治療這種疾病成為了臨床工作的難點(diǎn)[15]。Chen Xiaobin等通過建立老年大鼠髖部骨折的模型，取骨折后24h、48h、72h血液進(jìn)行芯片的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13個(gè)異常表達(dá)microRNA,其中差異最大兩組：microRNA-130a-3p表達(dá)下調(diào)，microRNA-150a-5p上調(diào)，其結(jié)果在肺組織中也得到了驗(yàn)證。[16]上述發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了髖部骨折中循環(huán)microRNA研究的空白，為老年髖部骨折患者的診斷提供了潛在生物標(biāo)志物，在法醫(yī)學(xué)的骨折損傷時(shí)間鑒定中的應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究。

（二）股骨骨折

股骨骨折又被稱為“股骨干骨折”。造成股骨骨折原因大多是強(qiáng)烈的暴力所致，好發(fā)于青壯年，男性多于女性。Waki Takahiro等[17]在股骨干骨折標(biāo)準(zhǔn)愈合組和未愈合組的第14天的基因芯片和熒光定量中的研究發(fā)現(xiàn)五個(gè)差異表達(dá)的microRNA:miR-140-3p，miR-140-5p，miR-181a-5p,miR-181d-5p和miR-451a,其可能在骨折愈合的過程中發(fā)揮著重要作用。Sylvia Weilner[18]等在絕經(jīng)后的女性股骨骨折的血液中提取microRNA，發(fā)現(xiàn)可能與骨折愈合相 關(guān) 的 6 個(gè) microRNA:miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-133b、miR-22-3p、miR-328-3p 和 let-7g-5p。Koichi Murata[19]等在股骨轉(zhuǎn)子間骨折的患者與正常對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)，血漿miR-91a在骨折后的24小時(shí)內(nèi)顯著下降，為了驗(yàn)證miR-91a對(duì)骨折的影響，在小鼠的體內(nèi)注射抗miR-91a，發(fā)現(xiàn)骨痂量明星增多，促進(jìn)了骨折的愈合。在股骨骨折的不同時(shí)間中循環(huán)microRNA的表達(dá)有著不同的研究結(jié)果，在損傷時(shí)間的推斷中的應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究。

（三）踝關(guān)節(jié)骨折

踝關(guān)節(jié)骨折作為一種常見的骨折[20]，大多由間接暴力引起，例如交通事故、摔跌、扭傷等，青年人群中尤其多見。Deping Sun[21]選取了28例臨床上踝關(guān)節(jié)骨折的病人，其中15例在骨折后的1～7天內(nèi)接受手術(shù)治療，13例在骨折后的8～14天內(nèi)接受手術(shù)治療。手術(shù)當(dāng)天提取血液microRNA,發(fā)現(xiàn)與1～7天手術(shù)組相比，8～14天手術(shù)組踝關(guān)節(jié)血液組織中miR-185表達(dá)水平明顯降低，其結(jié)果也在骨組織中得到驗(yàn)證,miR-185通過調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞的增值，與骨的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，將為踝關(guān)節(jié)骨折損傷時(shí)間推斷提供新的生物學(xué)標(biāo)記物。

（四）脛腓骨骨骨折

脛腓骨骨折多見于中青年男性，[22]脛骨骨折約占四肢長骨骨折的3%～4%，[23]由直接暴力引起。Zou L[24]等在脛骨遠(yuǎn)端干骺端骨折的患者血液中發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p與BMP6mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。而BMP6可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制骨折的愈合，因此miR-124-3p表達(dá)量升高對(duì)骨折愈合則呈正向的促進(jìn)作用，可以作為一種預(yù)測以及治療脛骨遠(yuǎn)端干骺端骨折愈合的生物標(biāo)志物,但是目前尚未有關(guān)于其在骨折損傷不同時(shí)間中表達(dá)量變化的相關(guān)數(shù)據(jù)，因此其作為脛腓骨骨折的特異性生物學(xué)標(biāo)記物在法醫(yī)骨折損傷時(shí)間的推斷有待進(jìn)一步的研究。

（五）肱骨骨折

Chunfang Ju[25]等在肱骨骨折的患者中發(fā)現(xiàn)，骨折后8-14天接受手術(shù)的患者比骨折后1～7天接受手術(shù)的患者血液中的miR-421相對(duì)表達(dá)量明顯降低，雙熒光素酶結(jié)果顯示BMP-2是miR-421的直接作用的靶基因。進(jìn)而可以推斷miR-421可能是通過BMP-2來對(duì)肱骨骨折進(jìn)行修復(fù)。至于循環(huán)miR-421是否可以應(yīng)用到骨折的損傷的領(lǐng)域有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

（六）手部骨折

手部骨折，在生活中常見，以老年人為主，多為跌倒時(shí)掌部著地所致。徐棟[26]在臨床上選取手部骨折的患者，于損傷后24小時(shí)內(nèi)抽取血漿，同時(shí)在固定后的7天、14天、21天分別抽取血漿，用正常人的血漿作為對(duì)照。研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)血漿miR-28-3p的相對(duì)表達(dá)量在固定后的14天、21天有了顯著下調(diào)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與骨折愈合存在負(fù)相關(guān)，為骨折損傷時(shí)間的推斷提供了新的生物學(xué)標(biāo)記物。但是其表達(dá)量與損傷時(shí)間的關(guān)系，是否可以推導(dǎo)出相關(guān)數(shù)學(xué)模型，為法醫(yī)鑒定提供客觀的依據(jù)，有待進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

（七）脊柱骨折

Ahn Tae-Keun[27]等通過對(duì)絕經(jīng)后女子的骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的易感性研究中發(fā)現(xiàn)，miR-146a,miR-149,miR-196a2和miR-499的多態(tài)性與之相關(guān)，可以作為預(yù)測易感性的一種指標(biāo)。由于脊柱骨折的循環(huán)microRNA的研究數(shù)據(jù)較少，尚無循環(huán)microRNA特異性的表達(dá)及與損傷時(shí)間的相關(guān)報(bào)道，因此在日后則需要更多地關(guān)注于這方面的研究。

三、循環(huán)microRNA在法醫(yī)骨折時(shí)間鑒定中的應(yīng)用及展望

綜合以上的研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)循環(huán)microRNA在骨的代謝、發(fā)育、修復(fù)等方面正發(fā)揮著重要的作用。[28]大量的研究數(shù)據(jù)顯示，一種或多種循環(huán)microRNA有可能作為特定骨折損傷部位的生物學(xué)標(biāo)記物，在臨床的診斷和治療中發(fā)揮巨大的潛力。[29]目前循環(huán)microRNA在骨折損傷領(lǐng)域的研究成為熱點(diǎn)，但是尚未有循環(huán)microRNA在法醫(yī)損傷領(lǐng)域應(yīng)用的報(bào)道，相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將會(huì)發(fā)現(xiàn)骨折損傷部位及隨著骨折損傷時(shí)間表達(dá)的特異性的循環(huán)miRNA，為骨折損傷的鑒定提供新的方法。在法醫(yī)實(shí)踐中，骨折部位確定、時(shí)間推斷、性質(zhì)判定是其重要內(nèi)容，不僅在新舊骨折判定、損傷程度確定發(fā)揮著重大作用，同時(shí)也在損傷時(shí)間、死亡時(shí)間和骨折發(fā)生后的存活時(shí)間推斷，以及死亡原因、損傷方式、命案現(xiàn)場分析等多個(gè)方面提供重要的技術(shù)支撐。對(duì)申請(qǐng)損傷鑒定的被鑒定人來說，準(zhǔn)確地判斷損傷的具體時(shí)間，往往涉及案件具體確定侵害人、侵害車輛，以及后期所需的營養(yǎng)期、誤工期、護(hù)理期等賠償費(fèi)用的確定。對(duì)于死亡案（事）件而言，骨折損傷鑒定則是服務(wù)于案件定性、確定嫌疑人的需要，以及為法庭訴訟提供訴訟依據(jù)。因此一種客觀精確的鑒定方法，是司法實(shí)踐、維護(hù)社會(huì)公平正義的迫切需求。而循環(huán)microRNA作為一種小RNA可以穩(wěn)定地存在，對(duì)于一些微量的檢材更有價(jià)值，相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，microRNA將會(huì)應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域，為司法鑒定提供更加客觀的依據(jù)。