蘇博美利奴羊胚胎期WNT2基因的組織表達及其生物信息學預測分析

楊雪梅，范 雪，田可川，黃錫霞，朱 樺，阿布來提·蘇來曼，陳華峰，何軍敏，趙冰茹，徐新明，付雪峰，田月珍，吳偉偉，哈尼克孜·吐拉甫，杜建文

(1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】蘇博美利奴羊是通過系統(tǒng)選育而成的羊毛細度為17.0～19.0 μm精紡用超細毛羊新品種，該品種成年公羊和母羊肩胛部平均羊毛細度的最細記錄分別為16.42、17.85 μm[1]。羊毛的生長發(fā)育與毛囊的結構和特性密切相關，中國超細毛羊(甘肅型)在胎齡138 d時，大部分初級毛囊與部分次級毛囊發(fā)育成熟[2]。而蘇博美利奴羊在胚胎期65 d，初級毛囊形成；在胚胎期85 d次級毛囊形成；在胚胎期105 d次級獲得性毛囊形成；在胚胎期135 d，毛囊基本成熟[3]?！厩叭搜芯窟M展】羊毛的品質及其商業(yè)價值是由毛囊的結構和特性決定，若想要提高羊毛的品質及產量，要研究其毛囊的發(fā)生發(fā)育，增加與毛囊發(fā)育有關基因的功能了解，才能更好的提高羊毛的質量與產量。在毛囊發(fā)育過程中，幾種分泌的信號分子家族涉及表皮和真皮之間的通信[4-5]。其中，WNT家族似乎是表皮早期發(fā)育的最早和最關鍵的調節(jié)因子[6]。WNT2基因是WNT家族的成員之一，與腫瘤的形成與轉移[7]。有研究表明，WNT2基因在細胞的生長、增殖過程中起重要作用[8]。此外，Fu J等[6]不僅確定了產生WNT的細胞類型，還揭示了在毛囊形態(tài)形成的不同階段WNT信號的高度調節(jié)動態(tài)。推測WNT2基因可能是綿羊毛囊發(fā)育的潛在關鍵基因。【本研究切入點】在過去的幾年里，已經對該品種進行了毛囊結構[3]、表達分析[9-10]及產毛性狀[11]的研究，調節(jié)羊毛生長的分子機理尚未完全了解。毛囊發(fā)育相關基因的表達研究、轉錄因子預測分析及生物信息學分析可能是闡明羊毛生長分子調控機制的另一種策略?！緮M解決的關鍵問題】采用qRT-PCR法對蘇博美利奴羊毛囊成熟時期WNT2基因在不同組織中的表達進行研究，使用PROMO軟件預測WNT2基因啟動子區(qū)域序列的轉錄因子，并用Cytoscape_v3.5.1軟件可視化，使用MEGA 7.0軟件分析WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分及密碼子的偏好性，并且利用綿羊、山羊、牛、人等9個物種的WNT2基因的DNA序列構建系統(tǒng)進化樹。為了解蘇博美利奴羊WNT2基因的分子結構和進化特征奠定基礎，進一步揭示WNT2基因在羊毛性狀調控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

從新疆科創(chuàng)繁育中心采集3只2周歲左右健康無病、體況均勻的經產蘇博美利奴母羊(平均纖維直徑約17.73 μm)胚胎期135 d(毛囊成熟時期)左側肩胛部皮膚組織及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織。將各組織樣本保存于液氮中，且均為3個生物信息學重復。

1.1.2 主要試劑

EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox購自ABM(加拿大)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自TakaRa公司(日本)、DL 2000 DNA Marker與6×Loading Buffer購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

取組織樣品50～100 mg于液氮中研磨，使用Trizol法對蘇博美利奴羊的7個組織樣品進行總RNA的提取。使用核酸檢測儀檢測其濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；將檢測合格的總RNA根據反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。

1.2.2 引物設計與合成

根據NCBI上公布的綿羊WNT2基因(GenBank NO. NM_001195319.1)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank NO. NM_001190390.1)的序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，最后由上海生工生物工程有限公司合成。表1

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

以cDNA為模板，對目的基因WNT2進行PCR擴增，反應體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序為95℃ 3 min，94℃ 30 s，63℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃ 5 min。隨機選擇4個PCR產物取2 μL與3 μL的6×Loading Buffer混勻，經2%瓊脂糖凝膠180 V電泳25min，以DL2000為Marker來標記產物片段的大?。恢笫褂媚z成像儀進行照膠，若獲得的產物片段與預期片段大小一致，可進行下一步試驗。

實時熒光定量PCR以蘇博美利奴羊不同組織反轉錄的cDNA為模板，以GAPDH基因為內參基因進行，反應體系為20 μL：EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應程序為95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，共40個循環(huán)，65℃ 5 s，95℃ 5 s。每個樣品均為3個生物信息學重復。

1.2.4 轉錄因子的預測、核苷酸組成及密碼子偏好性

下載NCBI上公布的綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列，使用在線軟件PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi dirDB=TF_8.3)對該基因進行轉錄因子的預測，并用Cytoscape_v3.5.1軟件進行可視化；使用MEGA 7.0軟件估計綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成及密碼子偏好性分析。

1.2.5 系統(tǒng)進化樹的構建

下載NCBI上公布的綿羊(Sheep)、山羊(Goat)、牛(Bos taurus)、人(Human)、馬(Horse)、豬(Pig)、恒河猴(Rhesus monkey)、北白頰長臂猿(Northern white-cheeked gibbon)、蘇門答臘猩猩(Sumatran orangutan)、兔(Rabbit)、家鼠(House Mouse)等11個物種的WNT2基因的DNA序列，使用MEGA 7.0軟件進行多序列比對，構建系統(tǒng)進化樹。

1.3 數據處理

蘇博美利奴羊不同組織中目的基因WNT2基因與內參基因GAPDH基因的相對表達量采用2-△△Ct方法進行計算，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt目的組-ΔCt對照組，并用SPSS 19.0軟件單因素方差分析中的Duncan′s多重比較對表達量結果進行差異比較。

2 結果與分析

2.1 PCR產物檢測

研究表明，擴增出來的片段是109 bp，與預期的大小相同，無非特異性擴增的條帶，反應體系合理，反轉錄的cDNA可以用于后續(xù)的試驗。圖1

注：M：DL2000 DNA Marker；1-4：WNT2基因

2.2 實時熒光定量PCR檢測

研究表明，WNT2基因與GAPDH基因有且只有一個峰，WNT2基因的熔解溫度為84℃，GAPDH基因的熔解溫度為84.5℃，引物特異性強。圖2，圖3

圖2 WNT2基因的擴增曲線(A)、熔解曲線(B)及熔解峰(C)Fig.2 Amplification Curve(A), Melting Curve(B) and Melting Peak(C) of WNT2 Gene

圖3 GAPDH基因的擴增曲線(D)、熔解曲線(E)及熔解(F)Fig.3 Amplification Curve(D), Melting Curve(E) and Melting Peak(F) of GAPDH Gene

2.3 WNT2基因在胚胎期135 d不同組織中的表達

研究表明，皮膚的ΔCt值最小，將皮膚作為對照組進行表達量的計算。WNT2基因在各組織中均有表達，但表達量各不相同。WNT2基因在皮膚組織中的表達量極顯著的高于其他6個組織(P<0.01)，且WNT2基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉6個組織之間表達差異不顯著(P>0.05)。圖4

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.4 轉錄因子的預測

通過使用在線軟件PROMO對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列進行轉錄因子的預測分析，并用Cytoscape_v3.5.1軟件可視化，研究表明，共預測出101個與綿羊WNT2基因相關的轉錄因子。這些轉錄因子與WNT2基因存在一定的調節(jié)關系，可能是正向調控，也可能是負向調控。圖5

圖5 WNT2基因啟動子區(qū)域轉錄因子Fig.5 Transcription factors in the promoter region of WNT2 gene

圖6 核苷酸組成成分Fig.6 Nucleotide composition

2.5 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列核苷酸組成成分

通過使用MEGA 7.0軟件分析了WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分，研究表明，WNT2基因啟動子區(qū)域序列的4種堿基的所占比例大致相同，T為25.90%，C為24.90%，A為25.80%，G為23.30%。圖6

2.6 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列密碼子偏好性分析

研究表明，共有667個密碼子在綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域，而編碼氨基酸的密碼子有644個。其中，AAA的數量最多，共有26個，占總密碼子的3.9%；而CGU的數量最少，有2個，占總密碼子的0.3%。RSCU值說明了同義密碼子的相對使用度，AUG與UGG的RSCU值為1，這兩個密碼子的使用不存在偏好性；CAG與UCU的RSCU值相對其他密碼子較大，分別為1.42和1.40，說明這兩個密碼子是使用相對較多的密碼子；而CCG與CGU的RSCU值相對其他密碼子較小，分別為0.41和0.23，這兩個密碼子是使用相對較少的密碼子。通過對密碼子的數量及RSCU值的分析發(fā)現，密碼子數量與使用偏好性不存在直接的關系。表2

研究表明，667個密碼子決定了20種氨基酸，而每一種氨基酸的所占比例各不相同。絲氨酸的由73個密碼子決定，而甲硫氨酸僅由5個密碼子決定。圖7

圖7 密碼子決定氨基酸種類Fig.7 Types of amino acids determined by codons

2.7 系統(tǒng)進化樹

通過使用MEGA 7.0軟件構建了綿羊、山羊、牛、人、馬、豬、恒河猴、北白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩、家鼠與兔等11個物種的WNT2基因的DNA序列系統(tǒng)進化樹，由研究表明，家鼠和兔與其他9個物種進化距離較遠，而這9個物種聚為了2個大的分支，綿羊、山羊、牛、馬、豬聚在一個大的進化分支，而人、恒河猴、北白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩聚在另一個大的進化分支。圖8

圖8 WNT2基因的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic Tree of WNT2 Gene

表2 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列密碼子偏好性Table 2 Codon preference in the promoter region of sheep WNT2 gene

3 討 論

WNT信號通路參與細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等過程，以及鄰近細胞間的相互作用[12-13]。一些研究表明，WNT信號通路廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生的各個環(huán)節(jié)[14]，該通路對所有類型毛囊形態(tài)發(fā)生都是非常重要[15]，尤其在毛囊發(fā)生的起始階段起到至關重要的作用[16]。根據以往的研究，已知毛發(fā)的生長發(fā)育受毛囊周期變化的調節(jié)[17]。WNT信號通路中的WNT2在毛囊形態(tài)發(fā)生中起到重要作用，調節(jié)毛發(fā)長度[18]。

研究采用qRT-PCR法對蘇博美利奴羊毛囊成熟時期WNT2基因在不同組織中的表達進行研究，結果發(fā)現WNT2基因在7個組織中均有表達，而在皮膚組織中的表達量極顯著的高于其他6個組織(P<0.01)。已有報道證明WNT2基因在山羊各組織中均有表達，但在胚胎期90 d時，WNT2基因在肺臟中的表達量高于皮膚，而在心臟、肝臟及腎臟的表達量低于皮膚[19]，與研究結果部分一致。可能是WNT2基因在不同品種羊皮膚組織中的表達量不同，也有可能是研究時期不同造成表達量不同。馮新宇[20]表明WNT2基因的表達下調會激活凋亡通路，造成細胞凋亡，進一步說明WNT2基因對毛囊的生長發(fā)育具有促進作用。

轉錄因子通過與啟動子上特定的DNA序列結合以激活或抑制特定基因的表達，研究通過對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的轉錄因子預測，共預測出101個相關轉錄因子，與WNT2基因存在或正或負的調節(jié)關系，但具體調控作用有待進一步研究。通過對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分分析發(fā)現，4種堿基呈現均勻分布。對密碼子偏好性分布分析發(fā)現，CAG與UCU是使用相對較多的密碼子，而啟動子區(qū)域的絲氨酸，由73個密碼子決定。在不同物種之間構建系統(tǒng)發(fā)育樹以揭示綿羊WNT2基因的系統(tǒng)發(fā)育關系，發(fā)現山羊和綿羊之間的進化關系比與其他動物進行比較時更為接近，這與薛麗娜等[21]的研究結果一致。

miRNA是轉錄后基因表達的重要調節(jié)因子，也可能是表型調控的潛在位點[22]。一些miRNA在細胞分化和皮膚毛囊的增殖中起著關鍵作用，它們的靶基因在毛囊的周期性生長中起著重要作用。Chen Y等[23]表明miRNA對WNT2基因表達的調節(jié)可能依賴于轉錄降解，miR-125a通過影響WNT信號通路中基因的mRNA表達水平參與毛囊發(fā)育，如WNT2、β-連環(huán)蛋白1 (Catenin beta 1,CTNNB1)、淋巴增強子結合因子1 (Lymphoid Enhancer Binding Factor 1,LEF-1)及過氧化物酶體增殖物激活受體δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta,PPARD)。WNT基因家族編碼大量分泌蛋白，作為信號蛋白在細胞間傳遞，使細胞分化。而研究結果表明WNT2基因在蘇博美利奴羊胚胎期135 d的表達量最高，說明WNT2基因編碼的WNT2蛋白可能在綿羊皮膚組織中大量存在。

4 結 論

WNT2基因在皮膚組織中的表達量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及肌肉組織。在綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列共預測出101個相關轉錄因子，4種堿基呈現均勻分布，CAG與UCU的是使用相對較多的密碼子，對WNT2基因的DNA序列系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現山羊和綿羊之間的進化關系比與其他動物進行比較時更為接近。