銀染聚丙烯酰胺凝膠電泳技術體系的優(yōu)化

王露露，劉欣婷，周 濤，王 娟，賈東海，李 強，侯獻飛，石必顯，顧元國，蘭海燕

(1.新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046；2.新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】按分子質量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定DNA分子的重要實驗手段。目前分離、鑒定和純化DNA片段的最簡便的方法主要為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)[1]。二者相比，瓊脂糖凝膠電泳以水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳，因分離DNA片段的范圍較廣、操作簡單、耗時短而被廣泛使用，但無法分辨質量差異小的DNA片段；而PAGE采用垂直電泳裝置，具有極高分辨率，長度相差1 bp或質量相差0.1%的DNA都可以彼此分離，但制備和操作較麻煩[2, 3]。PAGE孔徑的大小可通過控制丙烯酰胺(Acrylamide，Acr)單體和甲叉雙丙烯酰胺(Bisacrylamide，Bis)交聯(lián)劑的比例來調節(jié)，滿足不同分子量物質的分離要求[1]。1959年，Raymond和Weintraub將聚丙烯酰胺交聯(lián)鏈作為電泳支持介質[4]，經不斷改良，使其具有熱穩(wěn)定、分辨率高、上樣量少、不易擴散、靈敏度高等優(yōu)點[5, 6]，如今聚丙烯酰胺凝膠作為電中性的介質被廣泛應用于分離、鑒定、純化DNA和小分子多肽，是遺傳圖譜構建、基因定位、種子活力測定等遺傳育種研究的重要手段[7]，特別是在 SSR、AFLP、SNP、RAPD、RFLP 等分子標記以及 mRNA差異顯示研究中具有不可替代的作用[8, 9]。但 PAGE 技術包括凝膠制備、電泳分離、染色顯影等過程，操作步驟繁瑣復雜，費時費工，限制了大規(guī)模分子標記分析的效率，且實驗常出現(xiàn)條帶不整齊、不清晰、背景太深、膠破裂、有氣泡等問題[10]。【前人研究進展】前期對PAGE實驗的探究，大多集中在銀染方法的改良[11]、確定Acr和Bis的配比、最佳凝膠濃度及電泳條件等方面[10]，對實驗中具體問題的探討涉及較少。孟菲等[12]研究表明，固定液中的乙醇可清洗凝膠上殘留的雜質，提高凝膠的清晰度；乙酸可防止核酸分子從凝膠中脫離，但乙酸體積比在0.4%～3.0%之間時對凝膠顯色結果影響不大?！颈狙芯壳腥朦c】銀染聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)主要用于小片段DNA的分離，具有提高分辨率的顯著效果，但此技術在實驗過程中受到很多因素干擾，常導致實驗結果難以分析。研究在前期對甘藍型油菜基因組DNA PCR產物進行銀染PAGE分析時發(fā)現(xiàn)，電泳過程中經常出現(xiàn)染色較深、電泳條帶不清晰不整齊、條帶彌散、膠體有氣泡等問題。研究銀染聚丙烯胺凝膠電泳技術體系的優(yōu)化。【擬解決的問題】對銀染PAGE的條件進行優(yōu)化，并提出相應的改進方法，以獲得凝膠背景淺、條帶清晰的結果，為相關實驗提供借鑒及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)由新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所種植于試驗大田中，待苗長出3～6片真葉時，取新鮮幼嫩的3片真葉，提取植物基因組DNA。根據表1的5對引物進行PCR反應。表1

表1 油菜PCR引物Table 1 Seedrape varieties PCR primers

1.2 方 法

1.2.1 非變性PAGE膠的制備

6%聚丙烯酰胺凝膠的制備：5×TBE 5 mL，30% Acr-Bis(Acr 29 g，Bis 1 g，定容至100 mL)6.65 mL，N,N,N',N'-四甲基乙二胺(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED)15 μL，10%過硫酸銨(Ammonium persulphate，APS；0.1 g APS定容到1 mL)375 μL，ddH2O 12.75 mL。將混勻后的試劑迅速倒入玻璃板中間[面積105×185( mm)]，膠液溢出短板即可，小心插入樣品梳。室溫下放置30 min，待膠完全凝固后再進行后續(xù)實驗。

1.2.2 樣品制備

油菜基因組DNA PCR擴增產物與上樣緩沖液(5×TBE：三羥甲基氨基甲烷(Trizma base)54 g，硼酸(Boric acid)27.5 g，乙二胺四乙酸二鈉鹽二水(EDTA-2H2O-Na2)3.72 g，定容至1 000 mL)混合。在電泳槽中加入1×TBE，兩塊膠板中間緩沖液面超出短板即可，外槽加入適量的1×TBE。拔出樣品梳，驅趕出點樣孔內的氣泡后點樣。

1.2.3 電 泳

實驗使用北京六一儀器廠生產的DYY-8C電泳儀或BIO-RAD公司生產的PowerPac Universal TM Power Supply電泳儀，設定恒壓200 V。室溫或冰浴電泳65 min。

1.2.4 染 色

固定和滲透：電泳結束后，首先將膠塊置于固定液(無水乙醇50 mL，冰乙酸2.5 mL，定容至500 mL)中固定，搖床上緩慢搖動13 min；隨后，將固定好的膠塊用雙蒸水漂洗3遍后加入滲透液(硝酸銀1 g，定容至400 mL)，搖床上緩慢搖動13 min；最后，倒去滲透液并用雙蒸水漂洗3遍后。

顯色：(1)不同甲醛濃度顯色液的配制：5.5 g NaOH用雙蒸水定容至400 mL，分別加入5 mL、4 mL和5 μL甲醛，使其濃度為1.25%、1%和0.00125%(v/v)。(2)不同NaOH濃度顯色液的配制：分別稱取5 g、4.5 g、4 g和3.5 g NaOH用雙蒸水定容至400 mL，即其濃度為1.25%、1.125%、1%、0.875%(w/v)，加入4 mL甲醛(1%)進行實驗。將凝膠分別放入上述顯色液，在搖床上緩慢搖動，直至條帶清晰可見。

1.2.5 凝膠照像

倒去顯色液，用雙蒸水沖洗膠塊2～3遍，放于膠片燈下觀察記錄數(shù)據。

2 結果與分析

2.1 甲醛用量對條帶顯色的影響

在銀染過程中，Ag+與核酸形成穩(wěn)定復合物，甲醛將復合物中的Ag+還原成銀顆粒，使 DNA條帶呈現(xiàn)黑褐色?；谇捌趯嶒灲Y果不理想，本研究探究了甲醛用量(1.25%、1%及0.001 25%)對條帶顯色的影響。結果表明，當甲醛用量為1.25%時，顯色快，染色時間短，但背景顏色深，部分黑褐色區(qū)域覆蓋面積過大(圖1A)，無法判斷該區(qū)域是否存在擴增條帶。當用量為0.001 25%時，甲醛過低，即使長時間染色，目的條帶依然模糊(圖1B)。當甲醛用量為1%時，染色時間短，條帶清晰(圖1C)，是較為合適的甲醛濃度。圖1

M: DL 2000 DNA Marker; A: NFB-67引物對PCR的結果, 甲醇體積比為1.25%; B: NFB-33引物對PCR結果, 甲醇體積比為0.00125%; C: NFB-33引物對PCR結果, 甲醇體積比為1%

2.2 NaOH用量對條帶顯色的影響

NaOH可以產生堿性環(huán)境使凝膠顯色，為了探究NaOH用量對條帶顯色的影響，本研究在前期NaOH用量為1.375%導致染色背景較深(圖1)的情況下進行了下調，當濃度分別調整為1.25%(圖2 A)、1.125%(圖2 B)、1%(圖2 C)和0.875%(圖2 D)后，凝膠顏色稍有變淺，但沒有顯著差異，推測需與其他因素結合考慮。圖2

M: DL 2000 DNA Marker; A～D: NFB-33引物對PCR的結果, NaOH體積比分別為1.25%、1.125%、1%和0.875%

2.3 電壓對電泳條帶的影響

電壓對電泳結果有直接影響。研究對比了不同電壓值對電泳條帶清晰度的影響，結果顯示，當電壓在較低范圍時(110-130 V)，導致凝膠上部出現(xiàn)彌散條帶。之后將電壓穩(wěn)定到200 V并結合冰浴電泳時，每個泳道上的DNA樣品條帶都很清晰整齊，背景較為透明，彌散現(xiàn)象得到解決。圖3

M: DL 2000 DNA Marker; 1～24: NFB-111引物對的PCR結果

2.4 溫度對電泳條帶的影響

研究在室溫電泳時，凝膠條帶泳動速率不一致導致前沿不整齊，可能是外界溫度較高，電泳過程產生大量熱量無法散失導致。為了防止該現(xiàn)象發(fā)生，我們把電泳槽放入冰浴中進行電泳，結果顯示，低溫下的凝膠條帶未發(fā)生變形且前沿整齊一致。圖4

M: DL 2000 DNA Marker; 1～24: NFB-99引物對的PCR結果

2.5 氣泡對電泳條帶的影響

在制膠過程中如果操作不當，如加入試劑未充分混勻、凝膠不均一等因素都可能導致凝膠中產生少量氣泡，這些氣泡會擾亂核酸的運動軌跡，使DNA條帶發(fā)生彎曲或形變，導致實驗結果不利于觀察。如圖5泳道9和15所示。因此，在制膠和灌注過程中密切關注有無氣泡產生并及時驅趕(特別是小的)氣泡才能保證條帶的整齊和均勻一致性。圖5

M: DL 2000 DNA Marker; 1～24: NFB-36引物對的PCR結果

3 討 論

目前PAGE電泳技術已廣泛應用于生物化學、分子生物學、細胞學、酶學、免疫學和微生物分類等研究領域[13]。例如，PAGE用于轉基因成分的檢出[14]、抗體純度的鑒定[15]、糖化酶活力的快速檢測[16]、小麥種子純度的測定[17]等。盡管如此，由于PAGE技術涉及的因素較多，當實驗出現(xiàn)問題時，必須從眾多影響因素中逐一排查驗證，很大程度上影響了實驗的進度。目前研究顯示，固定液對實驗結果的影響甚微，滲透液(染色液)中硝酸銀的濃度也已經多次優(yōu)化[12]?；谇捌诮Y果，研究對顯色液(甲醛及NaOH)成分、電壓穩(wěn)定性、外界溫度、氣泡去除等因素進行了優(yōu)化，改良后的技術體系解決了背景顏色深、條帶彌散、凝膠變形及條帶不整齊等問題，可獲得條帶清晰、銀染效果良好的結果。

顯色液中的甲醛濃度過高時，顯色速度快，但難以控制顯色程度，且反差變小，使不同相對分子質量的 DNA條帶不能同步顯色，影響靈敏度[18]。甲醛濃度低(0.1%、0.15%、0.2%)時，顯色時間長，條帶不清晰且差異不大[19]。研究中甲醛濃度過高(1.25%)時，染色時間短，但凝膠背景加深；甲醛濃度過低(0.001 25%)時，染色時間長、背景色淺且條帶淡。經調整后，甲醛濃度為1%時，染色時間適宜，獲得了清晰條帶。

甲醛需要在一定的堿性環(huán)境中發(fā)揮還原作用，NaOH可以增加染色液堿性。雖然碳酸鈉也可以產生堿性環(huán)境使凝膠顯色，但NaOH在顯色過程中更可控且靈敏度高[18, 20]。王竹林與李西平等[11, 18]研究表明，NaOH作為顯色劑時，可以縮短顯影時間，但背景顏色加深，1.5%及3.0%NaOH顯色時結果無差別。因此，對低濃度范圍的NaOH用量進行細分后發(fā)現(xiàn)，0.875%、1%、1.125%、1.25%、1.375%的濃度染色效果差異并不顯著。

通常PAGE電泳過程中電壓高時，所需時間短；電壓低則相反。在確保電泳條帶良好的前提下，適當提高電壓，可以縮短電泳時間，提高效率[21]。但電壓過高會導致電泳溫度升高，散熱不均，凝膠出現(xiàn)“微笑效應”，即凝膠中部的樣品在電場的移動比左右兩側的快，導致條帶成為弧形[22]。研究針對此現(xiàn)象，將電泳裝置放在冰浴中電泳，從而降低凝膠溫度；或者降低電壓并延長電泳時間，使DNA條帶較為整齊。

在灌膠過程中，經常會產生大小氣泡并在膠凝過程中嵌入凝膠從而影響DNA條帶的遷移[23]。通常若氣泡較小不易趕走時，可端起制膠架在桌平面上輕敲，使氣泡上移浮出膠面；也可用注射器將氣泡吸出；或及時用針一類細長的器皿將氣泡趕出，從而避免影響DNA條帶的遷移。若出現(xiàn)大量無法消除的氣泡，則換干凈玻璃板并重新配膠，從而減少后期的不良效果。

4 結 論

研究對銀染聚丙烯酰胺凝膠電泳技術體系進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)制膠及時趕走氣泡；以穩(wěn)定的200 V電壓在冰浴中電泳；控制顯色液中的最佳甲醛濃度(1%)，NaOH濃度(0.875～1.375%)是較優(yōu)的實驗體系。使用優(yōu)化后的體系對油菜基因組DNA擴增的產物進行聚丙酰胺凝膠電泳并染色，可取得凝膠背景淺、條帶清晰、觀察效果好的結果。