天然環(huán)肽auyuittuqamide A 的全合成研究

耿晨晨，汪甜甜，李 翔，王小彥，姜云云（1.安徽醫(yī)科大學(xué)無錫臨床學(xué)院,江蘇 無錫 14044；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物化學(xué)教研室,上海 004；.重慶市婦幼保健院,重慶 400010；4.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院，江蘇 無錫 14044）

環(huán)肽主要源于植物、真菌，以及海洋天然產(chǎn)物和絕大多數(shù)生物有機(jī)體中[1]。環(huán)肽是具有特殊的生物活性和較強(qiáng)的藥理活性的一類化合物[2-3]。而且大多數(shù)環(huán)肽結(jié)構(gòu)比直鏈肽更加穩(wěn)定，且脂溶性高、穿膜性強(qiáng)、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，從而使環(huán)肽在抗腫瘤、抗病毒、天然領(lǐng)域中起著重要的作用[6-9]。

Auyuittuqamide A 是從極地海洋天然產(chǎn)物微孢子菌屬（RKAG186）中分離得到的一種環(huán)肽化合物，它是由10 個(gè)氨基酸殘基組成。Russell 等[10]從Sesquicillium microsporum中分離得到四個(gè)環(huán)十肽auyuittuqamide A-D。該類肽有一定的天然活性和對(duì)人體低毒性[11-12]。auyuittuqamide A 經(jīng)過核磁共振光譜法和串聯(lián)質(zhì)譜法證明了這類化合物的結(jié)構(gòu)。用Marfey 法[13]確定了氨基酸的絕對(duì)結(jié)構(gòu)。然而，天然產(chǎn)物中分離提取的auyuittuqamide A 的含量很低，很難推進(jìn)構(gòu)效關(guān)系和下一步的研究與應(yīng)用。因此，采用固相合成法合成環(huán)十肽具有成本低、時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[14-16]。

本文用2–氯三苯甲基氯（CTC）樹脂為固相載體，通過HOBT/DIC 為縮合體系，依次縮合氨基酸，完成全保護(hù)直鏈肽的合成。再以PyBOP/HOBT/DIPEA 為縮合體系，在DCM 溶液中液相環(huán)合[17-19]，隨后利用TFA 進(jìn)行保護(hù)基的脫除，進(jìn)而得到環(huán)十肽auyuittuqamide A（圖1）。

圖1 Auyuittuqamide A 的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

Fmoc-L–亮氨酸（Fmoc-Leu-OH）、Fmoc–甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）、Fmoc-L–纈氨酸（Fmoc-Val-OH）、Fmoc-O–叔丁基–L–絲氨酸（Fmoc-Ser(tBu)-OH）、Fmoc-L–異亮氨酸（Fmoc-Ile-OH）、N-（9–芴甲氧羰?；?N–甲基–L–苯丙氨酸（Fmoc-N-Me-LPhe-OH）、Fmoc-N–甲基–L–纈氨酸（Fmoc-N-Me-LVal-OH）、N-Fmoc-N–甲基–O–叔丁基–L–蘇氨酸（Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH）[希施生物科技（上海）有限公司]；2–氯三苯甲基氯（CTC）樹脂(上海吉爾生化有限公司)；N,N–二異丙基乙胺（DIPEA）、六氟磷酸苯并三唑–1–基–氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）、1–羥基苯并三氮唑（HOBT）、1,3–二異丙基碳二亞胺（DIC）、三氟乙醇（TFE）、三氟乙酸（TFA）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；N,N–二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈為色譜純。

CHA-S 氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；SK7200BT 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；LD5-2A 低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；低溫恒溫反應(yīng)?。ú郏?、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司）；WSZ-50A 軌道式振蕩器（上海－恒科技有限公司）；Waters2695/E2695 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；LC-1 型反向制備液相色譜儀（北京創(chuàng)新恒通科技有限公司）；6 538 UHD Accurate Mass QTOF LC/MS 質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

按圖2 路線，固相合成天然環(huán)肽auyuittuqamide A。

圖2 Auyuittuqamide A 的合成路線

1.2.1 直鏈肽固相合成

用稱量紙稱取2–氯三苯甲基氯（CTC）樹脂1 g（載樣量為0.45 mmol/g）于多肽固相合成反應(yīng)管中，加入DCM（10 ml）和DMF（10 ml）溶脹樹脂，20 min后抽干。用DMF 和DCM 沖洗5 遍，加Fmoc-Gly-OH（600 mg，2 mmol）和DIPEA（666 μl）的DMF 溶液入反應(yīng)管中，反應(yīng)管固定于CHA-S 氣浴恒溫振蕩器中常溫震蕩4 h。再用DCM 和DMF 各洗滌5 遍，抽干之后再加入20%哌啶的DMF 溶液（10 ml），重復(fù)2 遍，每一遍10 min，從而脫去氨基酸上的Fmoc 保護(hù)基，再依次使用DMF 和DCM 各洗滌5 遍。之后將已經(jīng)配置好的Fmoc–氨基酸–OH（2 mmol，5 倍當(dāng)量），HOBT（2 mmol，5 倍當(dāng)量），DIC（2 mmol，5 倍當(dāng)量）的DMF 溶液加入到反應(yīng)管中，反應(yīng)管固定于CHA-S 氣浴恒溫振蕩器中常溫震蕩2 h，反應(yīng)完成之后，再使用DMF 和DCM 沖洗5 遍。重復(fù)上述步驟，依次偶聯(lián)氨基酸Fmoc-NMe-L-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-N-Me-L-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH。

1.2.2 直鏈肽的切割與純化

所有氨基酸完成偶聯(lián)之后，獲得直鏈肽–樹脂復(fù)合物，使用無水乙醚將其揮干，加入TFE/DCM（1∶4，V/V）混合溶液10 ml，放置在軌道式振蕩器，常溫震蕩4 h。過濾并收集濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，獲得直鏈肽粗品，粗品用制備型RPHPLC 進(jìn)行純化，再使用凍干機(jī)將其干燥，獲得純品直鏈肽。

1.2.3 直鏈肽的環(huán)合

在0 ℃的條件下將直鏈肽溶于50 ml 的DCM溶液緩慢滴加入HOBT（3 eq）、PyBOP（5 eq）、DIPEA（10 eq）溶于DCM 50 ml 中，滴加完成之后，于常溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干反應(yīng)溶劑，獲得目標(biāo)粗品，再將粗品用制備型RP-HPLC 純化，再使用凍干機(jī)將其干燥，獲得純品環(huán)肽。

1.2.4 環(huán)肽側(cè)鏈保護(hù)基的脫除與純化

先配置脫除側(cè)鏈保護(hù)基溶液12 ml（TFA/DCM=1/3），將溶液加入到環(huán)肽凍干后的純品中，固定于軌道式振蕩器，常溫震蕩反應(yīng)4 h。

1.2.5 純化條件

色譜條件：Ryoung C18色譜柱（20mm×250 mm，10 μm）；流動(dòng)相A：水+0.1%TFA，流動(dòng)相B：乙腈+0.1%TFA，梯度洗脫：(0～5 min，40% B；5～60 min，40%～70% B)；流速：20ml/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 Auyuittuqamide A 直鏈肽的HPLC 和高分辨質(zhì)譜表征

本步是將直鏈肽從樹脂上切割，得到油狀物粗品360 mg，再將粗品進(jìn)行純化，得到純品100 mg，收率為：[實(shí)際值100mg/（理論值1 144×0.45 mmol）]×100%=19.42%，HPLC 圖譜如 圖3 所示，HR-QTOF-MS 質(zhì)譜圖中對(duì)應(yīng)的[M+H]+峰1 145.744 4，[M+Na]+峰1 167.726 6 顯示的分子量與直鏈肽auyuittuqamide A 相吻合。

圖3 Auyuittuqamide A 全保護(hù)直鏈肽HPLC (A)和HR-Q-TOF-MS (B)譜圖

本步是將直鏈肽純品進(jìn)行環(huán)合，得到油狀物粗品，再將粗品進(jìn)行純化，得到純品30 mg，此步收率為：[實(shí)際值30mg/（理論值1 126×0.45 mmol）]×100%=5.92%，HPLC 圖譜如圖4 所示，HR-Q-TOFMS 質(zhì)譜圖中對(duì)應(yīng)的[M+H]+峰1 127.734 6，[M+Na]+峰1 149.715 9 顯示的分子量與auyuittuqamide A 直鏈肽環(huán)合后分子量相吻合。

圖4 直鏈肽環(huán)合后HPLC (A)和HR-Q-TOF-MS (B)譜圖

本步是將環(huán)合后純品脫除側(cè)鏈保護(hù)基，得到油狀物粗品，再用乙腈和水溶解，最后凍干得到純品25 mg，收率為：[實(shí)際值25mg/（理論值1 014×0.45mmol）]×100%=5.48%，HPLC 圖譜如 圖5 所示，HR-Q-TOF-MS 質(zhì)譜圖中對(duì)應(yīng)的[M+H]+峰1 015.611 5，[M+Na]+峰1 037.593 7 顯示的分子量與環(huán)肽auyuittuqamide A 分子量相吻合。

圖5 Auyuittuqamide A 純品的HPLC(A)和 HR-Q-TOF-MS(B)譜圖

2.2 Auyuittuqamide A 的核磁共振氫譜表征

本研究通過500MHz 核磁共振氫譜對(duì)環(huán)肽進(jìn)一步表征，確認(rèn)與文獻(xiàn)中auyuittuqamide A 的核磁共振氫譜相符。1H-NMR (500MHz,d-DMSO)δ:8.91 (d,J=9.85 Hz,1H),8.70 (d,J=9.5Hz,1H),8.55 (d,J=6.95 Hz,1H),7.75 (t,J=5.5 Hz,1H),7.47?7.43 (m,3H),7.27?7.17 (m,5H),5.01 (d,J=9.75 Hz,1H),4.88 (m,1H),4.59?4.52 (m,2H),4.45(t,J=9.15 Hz,1H),4.39 (t,J=8.8 Hz,1H),3.32(dd,J=4.3 Hz,1H),3.88?3.82 (m,2H),3.78 (t,J=6.5 Hz,2H),3.74 (d,J=4.45 Hz,1H),3.33?3.27 (m,4H),3.22 (s,3H),3.17?3.13 (m,4H),2.98?2.93 (m,1H),2.48?2.45 (m,7H),1.97 (m,1H),1.87?1.82 (m,2H),1.64?1.60 (m,2H),1.20?1.13 (m,3H),1.01 (d,J=6.5 Hz,3H),0.86 (d,J=5.75 Hz,3H),0.82?0.78(m,17H),0.76?0.72 (m,5H),0.70 (d,J=6.45 Hz,3H)。

3 討論

本法采用先固相合成直鏈肽，再液相進(jìn)行環(huán)合獲得目標(biāo)產(chǎn)物auyuittuqamide A。并且采用先環(huán)合，再脫除側(cè)鏈保護(hù)基，從而有效地避免了側(cè)鏈裸露的羥基對(duì)環(huán)合時(shí)的影響[20]。使用高效液相色譜進(jìn)行純化，得到純品純度大于95%，收率為5.48%的目標(biāo)產(chǎn)物auyuittuqamide A。本研究首次完成了對(duì)auyuittuqamide A 的全合成，本法優(yōu)點(diǎn)：更為省時(shí)，方法簡(jiǎn)單，易于操作，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。缺點(diǎn)：產(chǎn)率還有待提高，方法需進(jìn)一步優(yōu)化?？偟膩碚f，本方法為該類環(huán)肽化合物的全合成提供了參考。