白藜蘆醇抑制血管緊張素Ⅱ/TLR4/NF-KB調(diào)控鼠血管平滑肌細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激損傷作用

梁冬冬，劉少奎，高新宇，王筱梅，王翠榮

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是造成腦梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑鹊闹饕?，其主要取決于血管內(nèi)膜病變及受累器官的缺血程度，其中氧化應(yīng)激損傷是動(dòng)脈粥樣硬化和支架內(nèi)再狹窄形成的重要機(jī)制[1,2]。在氧化應(yīng)激環(huán)境下，血管中層的平滑肌細(xì)胞的病理性增殖和氧化應(yīng)激的損傷，使平滑肌細(xì)胞的過度增殖、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的大量蓄積，最終加速促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程[3,4]。血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要因子，是由血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用下，水解產(chǎn)生的多肽物質(zhì)[5]。血管緊張素受體存在于人體的腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞、血管平滑肌、及心臟等器官的細(xì)胞上。Ang Ⅱ通過與血管緊張素受體結(jié)合，引起相應(yīng)的生理效應(yīng)，包括①使全身靜脈和微動(dòng)脈收縮，增加回心血量；②促使交感縮血管中樞處于緊張狀態(tài)；③促進(jìn)交感縮血管纖維遞質(zhì)釋放，增加其釋放量；④渴覺激發(fā)或增強(qiáng)[6,7]。因此，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性可有效減少血管緊張素Ⅱ生成，起到促進(jìn)血管舒張的作用。白藜蘆醇（Res）是多酚類化合物，在多種植物，如葡萄、花生等中較為常見，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇除了具有抗炎、抗衰老、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用之外，還可以通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖發(fā)揮心血管保護(hù)作用[8,9]。本研究主要通過以大鼠血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察白藜蘆醇是否可抑制Ang Ⅱ/TLR4/NF-KB信號(hào)通路，來緩解大鼠血管平滑肌細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激損傷作用，為白藜蘆醇在心血管病變的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7r5細(xì)胞株，購自武漢典型生物保藏中心。

1.2 CCK-8法檢測A7r5細(xì)胞存活率大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7r5細(xì)胞株用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分為對(duì)照組、RES組（30 μmol/L）、AngⅡ組（10-4μmol/L）和實(shí)驗(yàn)組（30 μmol/L RES預(yù)處理2 h+10-4μmol/L AngⅡ），按上述條件培養(yǎng)A7r5細(xì)胞株48h，接種于96孔板中，將培養(yǎng)基更換，再加入CCK8試劑（10 μl），37℃下孵育2 h，在450 nm波長處用酶標(biāo)儀測定其OD值，從而得到A7r5細(xì)胞存活率的結(jié)果。

1.3 ELISA檢測炎癥因子含量變化按上述條件培養(yǎng)48h后收集A7r5細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心14 min（4 ℃，3000 r/min），吸取上清液。采用ELISA法檢測TNF-α和IL-6。

1.4 試劑盒檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)改變細(xì)胞爬片后，分別給予空白對(duì)照、RES組（30 μmol/L）、AngⅡ組（10-4μmol/L）和實(shí)驗(yàn)組（30 μmol/L RES預(yù)處理2 h+10-4μmol/L AngⅡ），按上述條件培養(yǎng)48 h，采用試劑盒檢測ROS，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS改變。

按上述條件培養(yǎng)48 h后收集A7r5細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用試劑盒檢測細(xì)胞上清液中iNOS活性。

1.5 WesternBlot檢測蛋白表達(dá)水平按上述條件培養(yǎng)48 h后收集A7r5細(xì)胞，提取蛋白并檢測蛋白濃度，對(duì)蛋白樣品（總量20 μg/μl）進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白抗體孵育，二抗孵育，DAB顯色，計(jì)算AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行，行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，組間差異采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 A7r5細(xì)胞存活率

2.1 CCK-8法檢測A7r5細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比，AngⅡ組A7r5細(xì)胞株存活率升高，RES組和實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株存活率降低（P＜0.05）。與AngⅡ組相比，RES組和實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株存活率降低，實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株存活率下降更為明顯（P＜0.05）（圖1）。

2.2 ELISA法檢測TNF-α和IL-6表達(dá)變化與對(duì)照組相比，AngⅡ組A7r5細(xì)胞株TNF-α和IL-6表達(dá)升高，RES組和實(shí)驗(yàn)組TNF-α和IL-6表達(dá)降低（P＜0.05）。與AngⅡ組相比，RES組和實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株TNF-α和IL-6表達(dá)降低，RES組A7r5細(xì)胞株TNF-α和IL-6表達(dá)下降更為明顯（P＜0.05）（表1）。

2.3 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS和iNOS活性改變與對(duì)照組相比，AngⅡ組A7r5細(xì)胞株ROS和iNOS活性升高，RES組和實(shí)驗(yàn)組ROS和iNOS活性降低（P＜0.05）。與AngⅡ組相比，RES組和實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株ROS和iNOS活性降低，RES組A7r5細(xì)胞株ROS和iNOS活性下降更為明顯（P＜0.05）（圖2～3）。

2.4 WesternBlot檢測蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，AngⅡ組A7r5細(xì)胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量升高，RES組和實(shí)驗(yàn)組AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量降低（P＜0.05）。與AngⅡ組相比，RES組和實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量降低，RES組A7r5細(xì)胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量下降更為明顯（P＜0.05）（圖4）。

表1 ELISA法檢測TNF-α和IL-6表達(dá)變化結(jié)果

圖2 ROS活性改變

圖3 iNOS活性改變情況

圖4 WesternBlot蛋白表達(dá)含量

3 討論

白藜蘆醇（RES）又稱為芪三酚，對(duì)患者和機(jī)體無任何毒副性作用，具有抗腫瘤和抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)等作用，對(duì)心腦血管疾病具有預(yù)防和治療作用[10,11]。近年來研究證實(shí)，白黎蘆醇通過調(diào)節(jié)多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)心肌平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，抑制和緩解動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程[12,13]。

研究表明[14]：機(jī)體內(nèi)的各種生物因子之間存在緊密的聯(lián)系，且能相互作用、相互制約，從而處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。大鼠血管平滑肌A7r5細(xì)胞給予AngⅡ處理后，A7r5細(xì)胞存活率升高，炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS和iNOS活性升高，說明AngⅡ可有效刺激氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)，促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞異常增殖，最終引起血管壁的病理改變，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成進(jìn)程。有文獻(xiàn)表明[15]，白藜蘆醇可通過減少ROS生成以及降低動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡率來對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞氧化損傷，這與本研究中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS的變化相一致。與其他三組相比，RES組A7r5細(xì)胞株ROS和iNOS活性下降更為明顯（P＜0.05），藜蘆醇可以抑制ROS活性，降低一氧化氮合酶產(chǎn)生，并且減輕炎癥反應(yīng)。此外，文獻(xiàn)報(bào)道[16]，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)STAT3以及STAT3相關(guān)的信號(hào)通路抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。本研究中，給予白藜蘆醇干預(yù)AngⅡ的效果后，與AngⅡ組相比，RES組和實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株存活率降低，但均顯著高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組A7r5細(xì)胞株存活率下降更為明顯（P＜0.05），說明白藜蘆醇可抑制異常血管平滑肌細(xì)胞的增殖。從本研究結(jié)果看出：白藜蘆醇是通過抑制ROS活性、降低一氧化氮合酶產(chǎn)生，以及減輕炎癥反應(yīng)的途徑來實(shí)現(xiàn)抑制異常血管平滑肌細(xì)胞的增殖。

TLR4信號(hào)通路可激活NF-κB，從而刺激機(jī)體釋放炎癥因子[14]。NF-κB在靜息狀態(tài)下與其抑制性蛋白（IκB）結(jié)合，IκB 激酶（ IKK）復(fù)合體誘導(dǎo) IκB 磷酸化，NF-κB 逐漸活化并向細(xì)胞核移位，調(diào)控炎癥因子的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能在一定程度上通過TLR4通路抑制TLR4蛋白表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[17,18]。白藜蘆醇還可以通過調(diào)節(jié)NF-κB通路，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用[19]。本研究結(jié)果表明，給予白藜蘆醇干預(yù)AngⅡ的效果后，RES組和實(shí)驗(yàn)組鼠血管平滑肌A7r5細(xì)胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量顯著降低，并且RES組鼠血管平滑肌A7r5細(xì)胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量下降更為明顯（P＜0.05）。其機(jī)制主要是由于一方面，RES 能下調(diào)由AngII誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞 TLR4、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白水平的表達(dá)；另一方面，RES 能抑制 NF-κB p65入核，減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放[20-22]。

綜上所述，白藜蘆醇可有效緩解大鼠血管平滑肌細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激損傷，主要通過抑制血管緊張素Ⅱ/TLR4/NF-KB信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用。