內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白ATF4及CHOP在主動(dòng)脈夾層中的表達(dá)以及意義

陳若詩，吳琪，王志維

主動(dòng)脈夾層（AD）作為現(xiàn)今高發(fā)的一類大血管疾病，疾病進(jìn)展迅速、治療措施局限，患者死亡率高。其典型表現(xiàn)為主動(dòng)脈內(nèi)膜撕裂，血液涌入中膜內(nèi)，且沿中膜長軸剝離，形成真、假血管腔[1]。主動(dòng)脈夾層發(fā)生的早期病理改變?yōu)橹鲃?dòng)脈中膜囊性變（AMD），主要表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞缺失和凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、彈力纖維的斷裂等。其中，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的缺失和凋亡在導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層發(fā)生中有著極其重要的作用[2]。

研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等具有極其重要的作用，且有研究證實(shí)，ERS與多種心血管疾病如心肌肥厚、心肌缺血再灌注損傷等的發(fā)生密切相關(guān)[3]。但是，ERS在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中的作用及其在主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（VSMCs）凋亡中的聯(lián)系尚無報(bào)道。本研究通過分析ERS相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）和活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）在主動(dòng)脈夾層人體標(biāo)本和動(dòng)物標(biāo)本中的表達(dá)情況，研究其與主動(dòng)脈夾層發(fā)病過程中VSMCs凋亡的相關(guān)性，旨在為主動(dòng)脈夾層提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 人體標(biāo)本與實(shí)驗(yàn)分組選取2017年3月至2018年4月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診為StanfordⅠ型夾層并行胸主動(dòng)脈夾層全弓置換患者13例為AD組（n=13），患者均經(jīng)過CTA檢查確診為胸主動(dòng)脈夾層，三維重建的結(jié)果顯示破口產(chǎn)生于升主動(dòng)脈。所有患者術(shù)前均無冠心病、外周血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、膜性腎病?；颊呔谌朐汉笮屑痹\手術(shù)，我們?cè)谛g(shù)中取AD患者病變的血管組織。標(biāo)本取出后，預(yù)冷的生理鹽水漂洗主動(dòng)脈組織，一部分凍存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。另選取5例于武漢大學(xué)人民醫(yī)院接受心臟移植的患者作為Donor組（此5例患者均無大血管疾病，其在心臟移植術(shù)中取下的心臟主動(dòng)脈血管可作為相對(duì)正常主動(dòng)脈血管組織）。術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)方案均已告知家屬，并簽署知情同意書，且該部分實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型構(gòu)建選用SPF級(jí)野生型4周齡SD大鼠20只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2015-0027]；飼喂于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為AD組（n=10）及Control組（n=10）。AD組飼喂含0.3% β-異氨基丙腈酯（BAPN）的維持飼料進(jìn)行主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型構(gòu)建，Control組飼喂普通維持飼料。動(dòng)物模型構(gòu)建開始后密切觀察造模大鼠生存狀況，若大鼠于造模過程中死亡，立即解剖，明確死因，并收集主動(dòng)脈撕裂范圍的主動(dòng)脈組織標(biāo)本液氮凍存或4%多聚甲醛固定。4周后各組存活大鼠統(tǒng)一取材（AD組取主動(dòng)脈撕裂部位，Control組取相應(yīng)部位血管），主動(dòng)脈標(biāo)本液氮凍存或4%多聚甲醛固定用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑CHOP抗體購自美國Proteintech公司（貨號(hào)：15204-1-AP）；ATF4抗體購自美國Proteintech公司（貨號(hào)：10835-1-AP）；GAPDH抗體購自美國Proteintech公司（貨號(hào)：60008-1-Ig）?？故蠖官徸悦绹鳦ell Signaling technology公司（貨號(hào)：14709S）；抗兔二抗購自美國Cell Signaling technology公司（貨號(hào)：5151P）。TUNEL試劑盒購自中國生工（貨號(hào)：E607178）；β-氨基丙腈酯（BAPN）購自日本TCI公司（貨號(hào)A0796）。Trizol試劑購自美國BBI公司（貨號(hào)：B610409）。一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒，購自中國生工公司（貨號(hào)：B639277）；SYBR Green購自上海生工（貨號(hào)：B110031）。

1.4 TUNEL染色各組標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片。將切片置于60℃恒溫烘箱中烤片融蠟1 h，然后置于二甲苯溶液中進(jìn)一步脫去殘余石蠟，常規(guī)步驟水化，PBS漂洗。蛋白酶K消化修復(fù)切片；將TUNEL試劑盒相關(guān)試劑配置好后，根據(jù)說明書按步驟操作。染色完成后，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精脫色，蒸餾水漂洗，中性樹脂封片，全自動(dòng)顯微鏡下觀察。

1.5 Real-time PCR取約60 mg的人體及大鼠主動(dòng)脈標(biāo)本，加入適量Trizol，液氮研磨儀研磨，提取組織中總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度及純度，純度在1.9～2.0為合格，方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)所得RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，采用SYBR Green染料法以BIO-RAD RTPCR儀為平臺(tái)，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延長20 s，共40個(gè)循環(huán)，β-Actin作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所用主要引物條目及序列如下表：

1.6 Western-blot實(shí)驗(yàn)按照分組要求處理組織后，取約60 mg組織于1.5 ml EP管內(nèi)，加入含有適量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，液氮研磨儀研磨組織；所得樣品于冷凍離心機(jī)中以4℃ 12 000 rpm/min離心20 min，取上清，所收集上清液冰上超聲碎裂。根據(jù)所獲得蛋白上清液的體積，以適當(dāng)?shù)谋壤尤氲鞍咨蠘泳彌_液混勻，100℃金屬浴15 min，所獲蛋白樣本凍存于-80℃冰箱中。每孔蛋白上樣量為20 ug，電泳電壓90 V，電流40 mA，以10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠進(jìn)行Western blot電泳。在電流200 mA，電壓100 V條件下電轉(zhuǎn)2 h。其后TBST洗膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，GAPDH為內(nèi)參，以羊抗鼠、羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統(tǒng)上掃膜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析以SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人體標(biāo)本中，各組主動(dòng)脈組織中ATF4及CHOP表達(dá)比較兩組人體主動(dòng)脈組織標(biāo)本，石蠟包埋、切片后經(jīng)間苯二酚染色發(fā)現(xiàn)，AD組患者主動(dòng)脈血管組織中彈力纖維斷裂較Donor組正常主動(dòng)脈血管明顯增多，說明所選取的主動(dòng)脈夾層標(biāo)本符合主動(dòng)脈夾層發(fā)病后的血管組織病理改變。Masson染色發(fā)現(xiàn)，AD組患者血管組織中膠原沉積較Donor組正常主動(dòng)脈血管明顯增多；通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，AD組患者血管組織內(nèi)凋亡VSMCs較Donor組血管組織內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯增多（圖中紅色箭頭示凋亡陽性細(xì)胞），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD組患者主動(dòng)脈血管ATF4、CHOP的表達(dá)在RNA水平及蛋白水平均較Donor組正常主動(dòng)脈血管明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，各組主動(dòng)脈組織中ATF4及CHOP表達(dá)比較對(duì)兩組動(dòng)物所獲得的血管標(biāo)本石蠟包埋、切片后，進(jìn)行間苯二酚染色，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組基本無彈力纖維斷裂，AD組主動(dòng)脈損傷部位組織彈力纖維斷裂較對(duì)照組明顯增多；Masson染色發(fā)現(xiàn)，AD組主動(dòng)脈損傷部位組織膠原沉積較對(duì)照組顯著增多。以上病例特點(diǎn)均符合主動(dòng)脈夾層發(fā)病組織的病理改變，這也說明主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型的構(gòu)建基本成功。通過TUNEL染色我們發(fā)現(xiàn)，AD組主動(dòng)脈損傷部位主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著增加（圖中紅色箭頭所指即為凋亡陽性細(xì)胞），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD組主動(dòng)脈損傷部位組織CHOP及ATF4在RNA及蛋白水平均較對(duì)照組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

表1 不同種屬CHOP、ATF4、β-Actin特異性引物序列

本研究發(fā)現(xiàn)，人主動(dòng)脈夾層血管組織標(biāo)本中環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）和活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水平均較正常主動(dòng)脈血管組織標(biāo)本明顯增加，提示在主動(dòng)脈夾層發(fā)病過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯升高；同時(shí)，TUNEL染色顯示，主動(dòng)脈夾層組織中VSMCs凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多。因?yàn)槿梭w組織標(biāo)本之間存在年齡、性別、發(fā)病程度等多種差異，樣本均一性相對(duì)較差。為進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及相關(guān)蛋白在主動(dòng)脈夾層發(fā)病過程中的表達(dá)，我們構(gòu)建了主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了一致的結(jié)論，進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)升高可能與VSMCs凋亡具有密切的聯(lián)系。

圖1 兩組人體主動(dòng)脈組織標(biāo)本間二苯酚染色，Masson染色，TUNEL染色（400×）

圖3 各組大鼠主動(dòng)脈組織間二苯酚染色，Masson染色，TUNEL染色（200×）

圖4 各組主動(dòng)脈組織ATF4、CHOP蛋白及RNA表達(dá)水平

主動(dòng)脈夾層作為一類極其危險(xiǎn)的大血管疾病，基本病理變化表現(xiàn)為主動(dòng)脈VSMCs的丟失和凋亡過多，彈力纖維斷裂，細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積過多[2]。其中，VSMCs的數(shù)目減少及凋亡增多，是主動(dòng)脈舒縮功能障礙導(dǎo)致后期主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展的主要原因[4]。在主動(dòng)脈夾層發(fā)生過程中，VSMCs受到炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、血流剪切力等一系列外界刺激的影響，凋亡增多，進(jìn)而使得主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能受到影響，導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層的發(fā)生[5]。

許多因素可誘發(fā)主動(dòng)脈VSMCs發(fā)生凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，對(duì)于維持機(jī)體細(xì)胞功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有極其重要的作用。一旦機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，如氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受到影響，蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或未折疊蛋白集聚稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后會(huì)進(jìn)一步觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）[6]。此時(shí)，監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的一系列蛋白激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路蛋白如蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求蛋白（IRE-1）、活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），使蛋白質(zhì)折疊能力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)翻譯速率降低，并通過促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平；若經(jīng)此過程內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能有效緩解，則觸發(fā)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響機(jī)體或器官功能導(dǎo)致一系列臨床疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。其中PERK/ATF4/CHOP對(duì)于細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)具有極其重要的作用。

活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）由351個(gè)氨基酸構(gòu)成，作為PERK/ATF4/CHOP中的重要節(jié)點(diǎn)蛋白，通常在由PERK下游的真核起始因子2（eIF2）誘導(dǎo)下使其mRNA轉(zhuǎn)錄速率加快，蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而促進(jìn)CHOP的表達(dá)入核，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。CHOP也稱為GADD153，屬于CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族，與細(xì)胞增殖、分化及代謝的調(diào)節(jié)過程相關(guān)[9]。其主要由兩個(gè)功能域組成，一是N末端轉(zhuǎn)錄激活域和C末端堿性亮氨酸鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)域組成的富含堿性氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)域；其次是亮氨酸鏈?zhǔn)蕉刍?。有研究將CHOP不同結(jié)構(gòu)域進(jìn)行缺失突變發(fā)現(xiàn)，C末端堿性亮氨酸鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)域?qū)HOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡極其重要[10]。在機(jī)體正常情況下，CHOP表達(dá)較低，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)CHOP則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS通過CHOP可以調(diào)節(jié)許多細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，包括DOC、Bcl-2、TRB3和GADD34[12-14]。其中CHOP可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15]。同時(shí)，在CHOP敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠中，caspase-3、Bax活性及表達(dá)均明顯降低[16,17]。因此，CHOP可以通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)于細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有極其重要的作用。

綜上所述，在主動(dòng)脈夾層的發(fā)生過程中，多種因素刺激可內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4與CHOP表達(dá)顯著上調(diào)；若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)不能恢復(fù)，ATF4與CHOP則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路進(jìn)而導(dǎo)致主動(dòng)脈VSMCs的凋亡，促進(jìn)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展。明確主動(dòng)脈夾層發(fā)生的病理生理機(jī)制也為以后主動(dòng)脈夾層的早期治療提供了新的治療思路與靶點(diǎn)。