MPTP誘導(dǎo)樹(shù)鼩帕金森疾病模型行為學(xué)檢測(cè)方法研究

張志成 ， 宋慶凱 ， 黎曉慧 ， 李 娜 ， 黃 鑫 ， 袁 圓 ， 王 璇 ， 李明學(xué) ， 代解杰

（1. 昆明醫(yī)科大學(xué)， 昆明 650500; 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)， 昆明 650118)

帕金森疾病(Parkinson’s disease， PD)是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的復(fù)雜神經(jīng)退行性疾病， 發(fā)病機(jī)制尚不清楚。PD在疾病的早期階段有較好的對(duì)癥治療方法， 但這些治療方法并不會(huì)改變疾病的進(jìn)程。隨著PD的進(jìn)展， 步態(tài)變化和姿勢(shì)不穩(wěn)定性顯著[1]。PD患者的姿勢(shì)不穩(wěn)定常導(dǎo)致跌倒， 轉(zhuǎn)身或加重時(shí)導(dǎo)致各種損傷[2]。步態(tài)障礙與靜止性震顫嚴(yán)重影響著PD患者的生活質(zhì)量， 改善PD患者的運(yùn)動(dòng)癥狀是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)的PD行為學(xué)檢測(cè)方法， 如轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)[3]、爬竿實(shí)驗(yàn)[4]等， 不適用于善于跳躍、膽小易驚的樹(shù)鼩。本研究擬采用Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)、Force Plate Actimeter(FPA)分析系統(tǒng)對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP)致樹(shù)鼩急性PD模型的步態(tài)變化及肌肉震顫變化進(jìn)行分析， 旨在探索樹(shù)鼩PD模型新的行為學(xué)研究方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取成年普通級(jí)雄性滇緬樹(shù)鼩14只， 2歲， 體質(zhì)量為(147.6±17.07) g， 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心 [SCXK(滇)K2013-0001]提供。飼養(yǎng)于樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心普通環(huán)境中[SYXK(滇)K2013-0001]，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行儀器的適應(yīng)性訓(xùn)練，訓(xùn)練方法參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。隨機(jī)分為模型組(n=10)和對(duì)照組(n=4)，造模后對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[DWSP201801-004]。

1.2 試劑與儀器

MPTP (Sigma公司，美國(guó))，CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)(CatWalkTMXT，Noldus公司，荷蘭)，F(xiàn)PA分析系統(tǒng)(Basi公司， 美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹(shù)鼩PD模型的建立 實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩每日腹腔注射MPTP-HCl (4 mg/kg) 連續(xù)5 d，對(duì)照組注射同體積0.9%氯化鈉溶液[6]。

1.3.2 行為學(xué)檢測(cè)方法 造模后1 d對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行行為學(xué)數(shù)據(jù)采集。CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)(圖1)： 數(shù)據(jù)采集時(shí)，每只待測(cè)樹(shù)鼩必須無(wú)停頓通過(guò)檢測(cè)通道，每次至少3步，重復(fù)3次以上; FPA分析系統(tǒng)： 每次檢測(cè)前校正平板的四個(gè)壓力檢測(cè)裝置，然后將樹(shù)鼩至于封閉的檢測(cè)系統(tǒng)中，每只每次40 min。

本研究中，選取以下參數(shù)進(jìn)行分析： 站立時(shí)相持續(xù)時(shí)間(stand， s)： 爪印與玻璃板接觸的持續(xù)時(shí)間;最大接觸面積(max contact area， cm2)： 爪印與平板的最大接觸面積; 平均壓力(mean intensity， g)： 整個(gè)行走過(guò)程中，爪印與平板接觸過(guò)程中產(chǎn)生的平均壓力; 舉步時(shí)相持續(xù)時(shí)間(swing， s)： 爪印不與平板接觸的時(shí)間；跨步周期(step cycle， s)： 同一爪子接觸平板后到下一次接觸平板的時(shí)間; 身體速度變化率(body speed variation， %)： 通過(guò)將身體速度和平均速度之間的絕對(duì)差值除以平均速度來(lái)計(jì)算; 支持基礎(chǔ)(base of support， cm)： 前爪間或后爪間的平均距離;爪印位置(print positions， cm)： 同一跨步周期前爪和后爪間的距離; 平均力量(force average， g)： 整個(gè)檢測(cè)時(shí)段，檢測(cè)平板接受的平均壓力; BLM指數(shù)(bout of low mobility)： 檢測(cè)時(shí)限里計(jì)數(shù)低運(yùn)動(dòng)性出現(xiàn)的次數(shù)，每出現(xiàn)1次記為1; 測(cè)量區(qū)域(area measure)： 顯示檢測(cè)周期中動(dòng)物覆蓋的總面積，通過(guò)將每三個(gè)連續(xù)點(diǎn)創(chuàng)建的三角形面積求和而計(jì)算出來(lái); 空間利用指數(shù)(spatial statistic)： 測(cè)量整個(gè)平板上動(dòng)物活動(dòng)的分布，空間統(tǒng)計(jì)值為100表示動(dòng)物花在一個(gè)方格中的所有時(shí)間，空間統(tǒng)計(jì)值1表示平板上的所有方塊均等使用，本實(shí)驗(yàn)將數(shù)值＞30定為空間利用能力未受損;刻板評(píng)分(focused stereotopy)： 該分?jǐn)?shù)是基于檢測(cè)期間內(nèi)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的量和力的變化來(lái)計(jì)算的; 震顫指數(shù)(tremor indices， TI)： 特定頻率的肌肉震顫程度，其量化了高頻率段與低頻率段之間的力量差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS24.0及GraphPad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 計(jì)量資料以 x- ± s表示， 計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，計(jì)量資料組間比較采用成組t檢驗(yàn)、計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)指標(biāo)示意圖Figure 1 Catwalk gait analysis system indicators schematic

2 結(jié)果

2.1 MPTP誘導(dǎo)的樹(shù)鼩行為學(xué)表現(xiàn)

樹(shù)鼩在MPTP注射第5日時(shí)均出現(xiàn)典型的肉眼可見(jiàn)的PD運(yùn)動(dòng)癥狀，包括姿勢(shì)異常、肌肉震顫、站立不穩(wěn)，代表造模成功。肉眼可見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)癥狀短時(shí)間內(nèi)可恢復(fù)正常。對(duì)照組無(wú)異常表現(xiàn)(圖2)。

2.2 行為學(xué)檢測(cè)

2.2.1 空間和速度指標(biāo) 平均速度、測(cè)量區(qū)域、站立時(shí)相持續(xù)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離指標(biāo)，雖然有所變化，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空間利用指數(shù)下降、BLM指數(shù)顯著升高(P均＜0.001)(表1)。

2.2.2 步態(tài)與肌肉震顫相關(guān)指標(biāo) 造模后，步態(tài)指標(biāo)中支持基礎(chǔ)、跨步周期、身體速度變化率、爪印位置、站立相等， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，三足支撐、四足支撐比例有所升高，表明樹(shù)鼩運(yùn)動(dòng)能力未受到明顯損傷。爪印相關(guān)指標(biāo)中，樹(shù)鼩RF、LF最大接觸面積減少(P均＜0.05)，后爪無(wú)明顯差異; RF、RH、LF爪印最大接觸面積平均壓力，RF、RH、LF爪印平均壓力，四肢平均力量均下降(P均＜0.01); 舉步速度(LF)變快(P＜0.05); 反應(yīng)肌肉震顫程度的TI1(0～15 Hz)升高顯著(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 造模后樹(shù)鼩典型的PD運(yùn)動(dòng)癥狀Figure 2 Typical PD movement symptoms of tree shrews after modeling

表1 樹(shù)鼩空間和速度相關(guān)指標(biāo)Table 1 The space and speed related indexes of tree shrew

3 討論

MPTP是一種廣泛用于制作PD動(dòng)物模型的神經(jīng)毒素，主要通過(guò)氧化損傷和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物殺死多巴胺能神經(jīng)元[7]。MPTP小鼠模型是測(cè)試神經(jīng)保護(hù)劑有效性的經(jīng)典模型， 但是在神經(jīng)毒素模型中顯示，具有神經(jīng)保護(hù)作用的許多化合物在臨床試驗(yàn)中失敗[8]，可能由于嚙齒動(dòng)物多巴胺(DA)神經(jīng)元中無(wú)神經(jīng)黑色素表達(dá)且存在DA補(bǔ)償機(jī)制[9]。樹(shù)鼩在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育及心理應(yīng)激模式等方面與靈長(zhǎng)類(lèi)，甚至人類(lèi)高度相似，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域[10，11]。本中心前期研究[6]顯示，MPTP可致樹(shù)鼩PD樣癥狀，紋狀體DA和多巴胺脫羧酶抗體(DOPA)水平顯著降低， 腦中α-synuclein mRNA水平升高，提示樹(shù)鼩是良好的PD動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，探索樹(shù)鼩PD的行為學(xué)變化。

本文研究顯示，樹(shù)鼩MPTP建模后，平均速度、測(cè)量區(qū)域、站立時(shí)相持續(xù)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離、支持基礎(chǔ)、跨步周期、身體速度變化率、爪印位置、站立相等指標(biāo)，雖然有所變化，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以看出三足支撐、四足支撐比例有所升高。空間利用指數(shù)下降、BLM指數(shù)顯著升高(P均＜0.001)，表明樹(shù)鼩空間利用能力受損、活動(dòng)度下降，符合PD運(yùn)動(dòng)能力下降的特征。但四肢舉步速度中LF加快，這與Kim等[12]研究PD模型大鼠的肌肉僵直和運(yùn)動(dòng)功能減退可引起步幅和四肢擺動(dòng)速度顯著減少的結(jié)論不一致。

PD步態(tài)相關(guān)研究[13，14]表明，步幅、支撐點(diǎn)、最大接觸面積等可作為大鼠、小鼠PD步態(tài)分析的定量指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，MPTP致樹(shù)鼩PD的步態(tài)分析中，步幅、支撐點(diǎn)并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不能作為樹(shù)鼩定量分析的指標(biāo)。而RF、LF最大接觸面積減少，可作為PD步態(tài)分析的定量指標(biāo)。其他爪印相關(guān)指標(biāo)中，如RF、RH、LF爪印最大接觸面積平均壓力，RF、RH、LF爪印平均壓力，四肢平均力量均下降(P均＜0.05)，反映了樹(shù)鼩肌肉僵硬度升高，可以作為PD步態(tài)分析的定量指標(biāo)。

表2 樹(shù)鼩步態(tài)與肌肉震顫相關(guān)指標(biāo)Table 2 The Gait and muscle tremor related index of tree shrew

PD患者有著0～6 Hz的靜止性震顫[15]。楊謙謙等[16]采用MP150多通道生理信號(hào)采集器研究PD肌肉震顫情況，結(jié)果顯示部分大鼠肌肉震顫頻率和幅度均增加。本研究FPA檢測(cè)結(jié)果顯示，建模后與對(duì)照組相比，樹(shù)鼩在0～15 Hz(TI1)震顫顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TI2(15～25 Hz)雖然也上升明顯，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。FDA檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物無(wú)干擾、不束縛，不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激性生理變化，相比生理信號(hào)采集器，結(jié)果更可信、方法更簡(jiǎn)單。

PD患者的節(jié)奏性步行受短步幅和低速的阻礙，這與DA水平的降低有關(guān)[17]。步態(tài)障礙的研究可采用慢性的PD造模方案。PD早期通常不出現(xiàn)姿勢(shì)平衡障礙[18]，根據(jù)《2016中國(guó)帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)》[19]，新的診斷標(biāo)準(zhǔn)為了提高早期診斷率，去掉了帕金森綜合征中“姿勢(shì)平衡障礙”這一項(xiàng)?！斑\(yùn)動(dòng)遲緩”、“靜止性震顫”和“肌強(qiáng)直”3項(xiàng)核心運(yùn)動(dòng)癥狀的檢查必須按照統(tǒng)一PD評(píng)估量表[20]中所描述的方法進(jìn)行。

MPTP致樹(shù)鼩PD模型出現(xiàn)短暫的姿勢(shì)平衡障礙， 1 d后靜止性震顫、肌強(qiáng)直的表現(xiàn)是突出的，能較好模擬PD早期的臨床表現(xiàn)。本文行為學(xué)研究手段較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)等人為因素更少、檢測(cè)效率更高、檢測(cè)指標(biāo)更廣， 提供了一個(gè)系統(tǒng)、客觀、可靠的行為學(xué)研究方法，可綜合分析模型的多種行為學(xué)特征，值得進(jìn)一步深入研究和推廣。