復(fù)合小漿果果酒中的酚類物質(zhì)及其抗氧化活性分析

王婷婷，苑偉，李華,3*，王華,3*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100) 2(山東黑尚莓生物技術(shù)發(fā)展股份有限公司,山東 煙臺,264000)3(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌,712100)

小漿果是一類營養(yǎng)活性成分含量豐富的健康水果，是居民日常攝入的營養(yǎng)膳食，可對人體健康產(chǎn)生一定益處[1]。常見的小漿果包括在地中海國家大面種植的樹莓、黑莓等，還有如桑葚等原產(chǎn)于中國的小漿果，這些漿果含水率高，鮮果易變質(zhì)，適合釀造商業(yè)果酒[2-3]。在適量飲用的前提下，小漿果果酒中的營養(yǎng)活性成分可在機體內(nèi)發(fā)揮抗氧化等功效，小漿果果酒中發(fā)揮抗氧化作用最主要的植物化學(xué)成分就是包括花色苷和鞣花單寧在內(nèi)的各種酚類物質(zhì)[4-5]，其中鞣花單寧是一種廣泛存在于漿果中的天然酚類物質(zhì)，最常見的鞣花單寧組分包括鞣花酸和聚合的sanguiin H-6和lambertianin-C，通過酸水解，聚合的鞣花單寧發(fā)生酯鍵斷裂基團重排，轉(zhuǎn)化成鞣花酸[5]。

目前大多數(shù)關(guān)于果酒的研究都是對單品種果酒成分的分析[6-8]，對幾種水果釀造的復(fù)合果酒酚類物質(zhì)與抗氧化活性的研究未見報道。與單品種果酒相比，復(fù)合小漿果果酒不僅可以通過調(diào)整原料比例減少外源糖酸的添加，豐富口感和香氣復(fù)雜性，同時還可以提升果酒營養(yǎng)價值，最大程度滿足人們對果酒感官和營養(yǎng)的需求。

基于上述原因，本試驗測定不同原料配比的復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)含量及其自由基清除率，分析這些營養(yǎng)活性成分在果酒的保留率及自由基清除率的相關(guān)性，為復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)抗氧化相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為4款不同原料和配比的復(fù)合小漿果果酒，果酒原料為2016年不同月份采收的2種紅色和3種黑色小漿果，其中紅樹莓和黑加侖產(chǎn)自黑龍江省尚志市，紅枸杞產(chǎn)自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市，黑桑葚產(chǎn)自四川涼山彝族自治州，黑莓產(chǎn)自江蘇省連云港市。原料-40 ℃低溫速凍后在-20 ℃低溫冷藏，待全部采收后于9月初投料釀造。復(fù)合果酒配比按照山東黑尚莓生物技術(shù)開發(fā)股份有限公司復(fù)合果酒專利[9]按一定質(zhì)量百分數(shù)投料，4款復(fù)合小漿果果酒配比如表1所示。

表1 復(fù)合小漿果果酒配比Table 1 The formula of compound small berry wine

釀造工藝如下：

去除雜質(zhì)、破碎凍果→回溫至5 ℃、按0.02 g/kg的比例添加果膠酶→再回溫至10 ℃、按0.2 g/kg的比例添加酵母→15 ℃低溫發(fā)酵→分離原酒、調(diào)硫(40 mg/L)、滿罐儲藏→自然沉降倒罐下膠、酒泥壓濾紙板過濾→不銹鋼罐陳釀1年。

葡萄糖、CuSO4·5H2O、KIO3、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚、Folin-Ciocalteu試劑、Na2CO3、NaNO2、AlCl3、NaOH、KCl、C2H3NaO2·3H2O、FeSO4·7H2O、水楊酸和蘆丁(rutin，RE)：分析純，購于廣州金華化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸(gallic acid，GAE)、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、對香豆酸、反式阿魏酸、槲皮素、山奈酚和鞣花酸標準品：色譜純，購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；2,2′-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，購于上海阿拉丁生物化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C雷磁pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥器，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Cary60 UV-Vis紫外分光光度計，安捷倫科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測器，SIL-20A 自動進樣器及CLASS-VP工作站)，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料酚類物質(zhì)提取

準確稱取定量各凍果樣品冷凍干燥機中凍干，樣品干燥后粉碎。取1 g干粉于50 mL離心管，加入20 mL鹽酸甲醇溶液[V(鹽酸)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶600∶400]，超聲提取30 min后離心10 min，移取上清液，重復(fù)3次，合并上清液定容。

1.3.2 基本理化指標的測定

依據(jù)葡萄酒分析檢驗[10]，測定復(fù)合果酒的基本理化指標：酒精度采用密度瓶法；還原糖采用斐林試劑法，含量以葡萄糖計；滴定酸采用NaOH滴定法，含量以檸檬酸計；揮發(fā)酸采用NaOH滴定法，含量以醋酸計；總硫采用氧化法；維生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法。

1.3.3 總酚、總類黃酮、總花色苷和鞣花單寧的測定

總酚采用Folin-Ciocalteu法測定[11]，含量以沒食子酸表示。總類黃酮采用NaNO2-AlCl3分光光度法測定[12]，含量以蘆丁表示?？偦ㄉ詹捎胮H示差法測定[13]，含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside，C3G)表示。鞣花單寧采用HPLC測定[14]，樣品前處理方法為將待測樣與鹽酸甲醇[V(甲醇)∶V(鹽酸)=9∶1]等體積混合，85 ℃水解8 h。

1.3.4 單體酚的測定

單體酚采用HPLC測定[15]。酒樣前處理為酒樣、乙酸乙酯與乙腈以體積比為5∶5∶1混合，離心后移取上清液，重復(fù)3次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并的有機系蒸干，用甲醇溶解。色譜條件：Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；流動相：(A)為1%乙酸水溶液，(B)為50%乙腈水溶液(含1%乙酸)；洗脫梯度程序：0～3 min，10%；3～15 min，10%～15%B；15～25 min，15%～50%B；25～35 min，50%～60%B；35～45 min，60%～80%B；45～50 min，80%B；50～55 min，80%～10%B；進樣量20 μL；260 nm處檢測槲皮素和山奈酚，280 nm波長處監(jiān)測沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、兒茶素和表兒茶素，320 nm處檢測綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸。

1.3.5 抗氧化活性的測定

抗氧化活性分別采用ABTS、DPPH和羥基(·OH)自由基清除率的方法進行測定，ABTS和DPPH自由基清除率方法參照梁莎等[16]，羥基(·OH)自由基清除率測定方法參照SROKA等[17]。酒樣測定吸光值為Ai，用甲醇代替酒樣測對照值為Ac，自由基清除率的計算公式如式(1)。

(1)

公式(1)中：Ai，酒樣吸光值；Ac，對照吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

以上試驗均重復(fù)測定3次。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2007繪制圖表；SPSS 20.0的Turkey檢驗確定組間差異顯著性，不同小寫字母表示差異顯著；采用Pearson相關(guān)性分析方法檢驗并得出變量之間的相關(guān)系數(shù)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小漿果果實原料理化指標

表2為5種果實原料的理化指標。黑桑葚糖酸比最高，其次是紅枸杞，紅樹莓、黑莓和黑加侖的糖酸比均較低。黑色小漿果加入果膠酶后的出汁率均在78%以上，紅色小漿果的出汁率在50%～60%之間。紅枸杞和黑桑葚鮮果的維生素C含量均顯著高于其他3種小漿果。酚類物質(zhì)方面，黑桑葚總酚、總類黃酮和總花色苷含量均位于5種原料之首，其他2種黑色小漿果(黑加侖和黑莓)酚類物質(zhì)含量全部高于紅色小漿果。5種漿果中只有紅樹莓和黑莓含鞣花單寧，黑莓鮮果的鞣花單寧含量是紅樹莓的1.38倍。

表2 果實原料理化指標Table 2 The physicochemical indexes of the raw material

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 復(fù)合小漿果果酒理化指標及營養(yǎng)活性成分保留率

表3為復(fù)合小漿果果酒的理化指標，可以看出紅樹莓、黑桑葚、黑莓、黑加侖和紅枸杞5種原料釀造的復(fù)合小漿果果酒(A和B)與黑桑葚、黑莓和黑加侖釀造的復(fù)合小漿果果酒(C和D)相比，酒精度略低而殘?zhí)禽^高(均高于4.0 g/L)。C和D的滴定酸含量顯著低于A和B，這些說明可以通過調(diào)整復(fù)合果酒原料減少外源糖酸的添加。4款酒樣揮發(fā)酸和總硫分別低于GB 15037—2006中規(guī)定的1.2 g/L和GB 2758—2005的250 mg/L。C和D的維生素C的含量均高于A和B，相同原料不同配比的酒樣維生素C含量差異不顯著。C和D的總酚和總類黃酮含量顯著高于A和B，同時D酒樣的總酚含量顯著高于其他小漿果復(fù)合果酒，而D的總類黃酮含量與C沒有顯著差異。黑色小漿果占比高的總花色苷含量較多，D酒樣總花色苷含量遠高于其他。由于僅紅樹莓與黑莓中含有鞣花單寧，因此它們占比較高的復(fù)合果酒A和B鞣花單寧含量更高。

表3 復(fù)合小漿果果酒理化指標Table 3 The physicochemical indexes of compound small berry wine

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

經(jīng)過計算復(fù)合果酒與加權(quán)后的果實原料營養(yǎng)活性成分含量的比值得出復(fù)合果酒中營養(yǎng)活性成分保留率，由表4可知維生素C的平均保留率僅為13.52%，果實冷藏與果汁壓榨釀造及陳釀過程可能對維生素C產(chǎn)生了較大的負面影響[18-21]。

表4 營養(yǎng)活性成分保留率 單位：%

同時果實冷藏與果酒釀造及陳釀對不同酚類物質(zhì)產(chǎn)生了不同程度影響[22-23]，復(fù)合果酒總酚、總類黃酮、總花色苷和鞣花單寧的平均保留率分別為42.84%、52.32%、44.02%和50.54%，4種復(fù)合果酒的平均保留率大小為：D>C>B>A。

2.3 復(fù)合小漿果果酒單體酚含量

圖1是復(fù)合小漿果果酒單體酚的HPLC色譜圖，可以看出A和B沒食子酸、咖啡酸和對香豆酸含量顯著高于C和D。C和D原兒茶酸和綠原酸含量顯著高于A和B。表5是復(fù)合小漿果果酒單體酚含量，將HPLC檢測到復(fù)合小漿果果酒的酚酸分為羥基苯甲酸和羥基肉桂酸2類，這4款酒樣的羥基苯甲酸平均含量為85.78 mg/L，羥基肉桂酸平均為16.40 mg/L，比例約為5∶1，說明復(fù)合果酒中羥基苯甲酸，特別是沒食子酸和原兒茶酸占總酚酸含量比重較大。復(fù)合果酒的羥基苯甲酸含量大小為：B>A>C>D，羥基肉桂酸含量大小為：A>B>C>D，由此可知從整體上看A和B的總酚酸含量顯著高于C和D，C總酚酸含量顯著高于D。HPLC檢測到復(fù)合果酒單體類黃酮分為黃酮醇和黃烷-3-醇，黃酮醇含量大小為:C>A>D>B，黃烷-3-醇含量大小為：C>D>B>A，C中黃酮醇和黃烷-3-醇含量顯著高于其他3款復(fù)合果酒，與原料相同的D相比，黃酮醇和黃烷-3-醇含量仍高出27.02%和27.45%。

1-沒食子酸；2-原兒茶酸；3-綠原酸；4-兒茶素；5-對羥基苯甲酸；6-香草酸；7-咖啡酸；8-丁香酸；9-表兒茶素；10-對香豆酸；11-阿魏酸；12-槲皮素；13-山奈酚圖1 復(fù)合小漿果果酒單體酚HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of individual phenol ofcompound small berry wine

2.4 復(fù)合小漿果果酒自由基清除率

復(fù)合小漿果果酒的抗氧化活性較強，圖2是4款復(fù)合小漿果果酒的自由基清除率的比較，可以看出復(fù)合小漿果果酒ABTS自由基清除能力最強，清除率均在77%以上，DPPH次之，羥基(·OH)最弱。同時可以看到復(fù)合果酒ABTS自由基清除能力差異并不顯著，僅D的自由基清除率顯著高于其他酒樣。4款復(fù)合果酒的DPPH和羥基(·OH)自由基清除能力差異顯著，A和B自由基清除率顯著高于C和D酒樣。相同原料的酒樣羥基(·OH)自由基清除率沒有顯著差異，所有酒樣DPPH自由基清除率都有顯著差異，大小為：B>A>C>D，與總酚酸含量趨勢一致。

2.5 復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)含量與自由基清除率相關(guān)性

復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)與抗氧化活性關(guān)系密切，表6是復(fù)合果酒酚類物質(zhì)與自由基清除率的相關(guān)性。復(fù)合小漿果果酒中總酚與總類黃酮、總花色苷以及黃酮醇和黃烷-3-醇含量呈強的正相關(guān)(r>0.6)，與總酚酸和鞣花單寧呈極強的負相關(guān)性(∣r∣>0.8)。ABTS自由基清除率與總酚呈極強正相關(guān)性(r=0.817)，DPPH和羥基(·OH)自由基清除率與總酚、總類黃酮、總花色苷均為極強負相關(guān)性，與總酚酸和鞣花單寧則均呈極強正相關(guān)。C和D總酚含量較高，因此它們ABTS自由基清除率較高，A和B總酚酸和鞣花單寧含量較高，因此它們DPPH和羥基(·OH)自由基清除率較高。

續(xù)表5

出峰序號酚類化合物單體酚含量/(mg·L-1)ABCD類黃酮黃酮醇12槲皮素29.00±0.22b7.53±0.35d35.97±0.46a26.83±0.29c13山奈酚0.42±0.02c0.98±0.05a0.86±0.03b0.06±0.02d合計29.42±0.24b8.51±0.35d36.83±0.43a26.88±0.32c黃烷-3-醇4兒茶素32.50±1.21d37.25±2.21c72.12±0.65a51.33±1.28b9表兒茶素2.83±0.10b3.06±0.12a3.29±0.26a3.37±0.13a合計35.33±1.31d40.30±2.33c75.40±0.39a54.70±1.38b黃酮醇+黃烷-3-醇64.75±1.09d48.81±2.40c112.24±0.50a81.58±1.21b

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 復(fù)合小漿果果酒自由基清除率
Fig.2 Free radical scavenging rate of compound small
berry wine
注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

黑色小漿果釀造的復(fù)合果酒維生素C、總酚、總類黃酮、總花色苷以及黃酮醇和黃烷-3-醇含量高于有紅色小漿果加入的復(fù)合果酒，D的配比更佳；紅樹莓和黑莓釀造的復(fù)合果酒總酚酸和鞣花單寧含量較高，B的配比更佳。相同原料條件下B和D配比的復(fù)合果酒營養(yǎng)活性成分保留率也更高。復(fù)合果酒中總酚含量與ABTS自由基清除率、總酚酸和鞣花單寧含量與DPPH和羥基(·OH)自由基清除率極強正相關(guān)，因此全部以黑色小漿果釀造的復(fù)合果酒ABTS自由基清除能力較強，以紅樹莓為主要釀造原料的復(fù)合果酒DPPH和羥基(·OH)自由基清除能力較強。試驗表明復(fù)合小漿果果酒酚類物質(zhì)對抗氧化活性具有顯著影響，改變原料及配比可以顯著影響復(fù)合果酒各酚類物質(zhì)含量及其抗氧化能力，這為復(fù)合果酒滿足感官要求的前提下根據(jù)營養(yǎng)需求確定最佳原料和配比提供了一定的理論依據(jù)。

表6 酚類物質(zhì)與自由基清除率相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients of phenol contents and free radical scavenging rate

注：*顯著相關(guān)(P<0.05)；**極顯著相關(guān)(P<0.01)