基于電子鼻和頂空固相微萃取-氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析檸檬草中的揮發(fā)性成分

陳靜慧，石浩，張強，馬奕瑜，王洪新

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

檸檬草(Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf)，又名香茅，是一種生長于熱帶地區(qū)的多年生草本藥材，具有檸檬揮發(fā)性，既可入藥，也可食用，常以香料形式出現(xiàn)于越南、泰國等東南亞菜品中。在巴西，煎煮口服檸檬草是一種民間藥方。檸檬草性溫，味辛、甘，具有祛風(fēng)通絡(luò)、溫中止痛、止瀉的功效，可用于治療風(fēng)寒濕痹、脘腹冷痛、泄瀉、跌打損傷，以及由感冒引起的頭身疼痛等，其揮發(fā)性還具有安神、鎮(zhèn)靜、助眠的功效[1]。

通過水蒸氣蒸餾法得到檸檬草精油是目前檸檬草的主要應(yīng)用。近期研究發(fā)現(xiàn)，檸檬草精油具有抗菌、防腐、抗氧化、祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、助眠、抗抑郁、健胃、促消化的功效[2-5]。檸檬草標志性成分有橙花醛、香葉醛、檸檬烯、香茅醛及香葉醇等[6]，據(jù)《巴西藥典》，檸檬草精油中至少含有60%的檸檬醛(由互為順反結(jié)構(gòu)的橙花醛和香葉醛組成)。楊欣等[3]將檸檬草精油與合成抗氧化劑沒食子酸丙酯(propionate gallate, PG)從總體抗氧化能力、清除羥基自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力等3個方面做比較，實驗結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，檸檬草的總抗氧化能力及清除羥基自由基能力高于PG；清除超氧陰離子自由基能力高于PG。李楠[7]以豬油為介質(zhì)，以過氧化值為指標考察了檸檬草精油對油脂過氧化的抑制能力，研究發(fā)現(xiàn)，檸檬草精油在豬油中的抗氧化性與丁基羥基甲苯(butyl hydroxytoluene, BHT)相近。吳慧清等[8]發(fā)現(xiàn)，檸檬草精油對大腸桿菌(Escherichiacoli)8099、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、枯草桿菌黑色變種(Bacillussubtilis)ATCC9372、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 1 023 1和黑曲霉(Aspergillusniger)ATCCl6404具有顯著的抑菌效果。陳佳齡等[9]發(fā)現(xiàn)，檸檬草水提液具有較強的羥自由基清除能力，且該能力與樣品濃度呈正相關(guān)。陳麗芬等[10]發(fā)現(xiàn)，檸檬草水提物可以抵抗由高血糖引起的小鼠體質(zhì)量的下降。

電子鼻(E-nose)氣味指紋分析技術(shù)是將物質(zhì)揮發(fā)成分的整體信息即“指紋數(shù)據(jù)”得到的信號與數(shù)據(jù)庫中的信號作出比較和判斷，從而得出樣品氣味的綜合判斷結(jié)果，常用于不同揮發(fā)性物質(zhì)中組成成分的區(qū)別判定[11-12]。該技術(shù)可以在短時間內(nèi)迅速分析、判別樣品中的揮發(fā)性成分，目前已經(jīng)應(yīng)用于食品加工工藝的優(yōu)化和風(fēng)味品質(zhì)的監(jiān)控，用于判別赤霞珠葡萄酒、梨果醋、不同烘烤程度咖啡及不同品種蘋果中揮發(fā)性成分的差異[12-14]。頂空固相微萃取-氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(head-space solid phase micro-extraction followed by gas chromatography-mass specteometry，HS-SPME-GC-MS)是目前對揮發(fā)性樣品中成分進行定性分析的重要手段，具有操作簡單、進樣快、分析迅速、選擇性好、重復(fù)性高等優(yōu)點，整個分析過程集采樣、吸附、萃取、濃縮、進樣、分析于一體[14-16]。該技術(shù)可以對不同蠟梅屬植物葉片、貫葉連翹葉及大曲發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分進行快速比較和定性分析[17-20]。

目前對于檸檬草的研究主要集中于對其精油中成分及功效的研究，而對檸檬草作為代茶及香料食用時成分組成的研究很少。檸檬草精油主要應(yīng)用于化妝品及按摩用油，且提煉精油耗時長、溫度高，操作過程難以日常化。加熱回流、煮沸及沸水沖泡檸檬草，操作簡單，用時少且便于日?；ｋ娮颖墙Y(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)目前已經(jīng)成為對揮發(fā)性成分及揮發(fā)性物質(zhì)組成進行精確定性、定量分析有效手段[21-24]。本文擬采用電子鼻結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)比較及分析作為代茶飲用的檸檬草與檸檬草精油的主要揮發(fā)性物質(zhì)成分間異同，從而為檸檬草的實際應(yīng)用、鑒別及生產(chǎn)加工中質(zhì)量控制提供理論依據(jù)和有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料:檸檬草干葉，購于歐尚超市；檸檬草精油，購于阿拉丁試劑網(wǎng)；實驗用去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(AR224CN)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；400Y多功能粉碎機，鉑歐五金廠；HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普實驗儀器廠；美的電磁爐；TSQ Quantum XLS三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司；Heracles II快速氣相電子鼻，法國Alpha MOS S.A.有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理方法

處理組A采用加熱回流：將干凈檸檬草干葉粉碎、過篩，準確稱取5 g于250 mL圓底燒瓶中，以料液比1∶15(g∶mL)加入75 mL去離子水，95 ℃加熱回流30 min;處理組B采用煮沸法：精確稱取5 g粉碎、過篩后的檸檬草干葉，75 mL去離子水浸泡1 h后煮沸5 min;處理組C采用沸水沖泡：另取5 g精確稱量的檸檬草粉碎葉用75 mL沸水沖泡,待樣品處理完成后，過300目篩收集濾液，分別取3 mL濾液及檸檬草精油(標記為樣品D)移入20 mL頂空進樣瓶，每組取5個平行樣品，4 ℃保存，備用。

1.3.2 電子鼻檢測

以空氣為空白樣品;進樣量4 000 μL;孵化溫度70 ℃,前加熱35 s,初始箱溫50 ℃,初始等溫線80 ℃時，保持2 s,然后以3.0 ℃/s升溫到250 ℃,持續(xù)21 s;注射速度125 μL/s;注射器溫度200 ℃;注射時間37 s;捕獲溫度50 ℃,捕獲持續(xù)時間42 s;分流10 mL/min;恒定流速75.8 mL/min;初始壓力80 kPa,升壓速度1.67 kPa/s,最終壓力180 kPa;采集時間110 s,采集周期0.01 s;2個火焰離子檢測器溫度均為260 ℃。

表1 電子鼻傳感器信息Table 1 Information of E-nose sensor

1.3.3 HS-SPME-GC-MS檢測

(1)頂空固相微萃取:采用二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(50/30 μm,DVB/CAR/PDMS)固相微萃取頭，萃取前應(yīng)先對萃取頭進行老化，250 ℃老化30 min。

(2)氣相質(zhì)譜條件:采用HP-5 MS石英彈性毛細管柱(0.2 5 μm×250 μm×30.0 m)起始溫度50 ℃,無保留，每分鐘升溫5 ℃到240 ℃持續(xù)5 min。進樣壓力70 kPa,氣液流速20 mL/min，氣液時間2 min，質(zhì)譜傳輸線溫度230 ℃，萃取深度40 mm，穿透速度40 mm/s。解析時間5 min，載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min，不分流進樣，清洗流速50 mL/min；質(zhì)量掃描范圍(m/z) 30～500;電子電離源；電子能量70 eV。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

電子鼻數(shù)據(jù)的PCA、DFA分析由儀器自帶AlphaSoft V12.0及SPSS 20.0、Excel軟件進行處理，SPME-GC-MS檢測重復(fù)3次，結(jié)果通過儀器分析及對比NIST11、Wiley275譜圖進行檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻進行定性分析。各組分含量百分數(shù)采用峰面積歸一化法進行分析。

SPME-GC-MS保留指數(shù)(kovats index，KI)的計算：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻的成分分析

從圖1可知，第1主成分PC1(83.571%)與第2主成分PC2(9.106%)貢獻率之和在92%以上,表明可以用這2個主成分對通過不同提取方法得到的檸檬草提取物的揮發(fā)性成分進行概括分析。區(qū)分指數(shù)(discrimination index，DI)最大值為100，其值越大表明不同組數(shù)據(jù)之間區(qū)分度越好，一般≥80表示能夠有效區(qū)分[22]。本次實驗PCA圖顯示電子鼻區(qū)分指數(shù)為74(<80)，表示電子鼻不可以對不同樣品中的揮發(fā)性成分進行有效區(qū)分，即各組間差異小。進一步觀察圖1發(fā)現(xiàn)，不同樣品間的差異可以通過PCA圖上的距離表征，圖1中直線距離的長短表征差異性的大小，檸檬草精油(D)與浸泡后煮沸的檸檬草葉(B)差異主要體現(xiàn)在第二主成分軸上。沸水沖泡處理的檸檬草葉(C)與檸檬草精油(D)間第一主成分間差異小。而95 ℃回流30 min處理的檸檬草葉(A)與檸檬草精油(D)之間的差異主要體現(xiàn)在第二主成分軸上。

A-通過加熱回流得到的樣品；B-通過煮沸得到的樣品；C-沸水沖泡得到的樣品；D-檸檬草精油，下同圖1 不同提取方法處理后的檸檬草揮發(fā)性成分PCA圖Fig.1 Principal component analysis of volatilecomponents of Cymbopogon citratus obtained by differentextracting methods

從圖2雷達圖中可以看出，不同樣品氣味指紋圖譜基本相似，主要區(qū)別是含量的不同，在同一傳感器上相同保留時間內(nèi)成分的差異主要是量的差異。沸水沖泡得到的檸檬草水提物(C)中揮發(fā)性成分與檸檬草精油(D)最為接近。

圖2 不同提取方法處理后的檸檬草揮發(fā)性
成分雷達圖
Fig.2 Radar of volatile components ofCymbopogon
citratusobtained by different extracting methods

圖3 DFA分析是在PCA分析數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上擴大組間差距，縮小組內(nèi)差距，以更加直觀的形式體現(xiàn)不同樣品間差異的分析方法。在圖3中，第一判別因子(DF1)與第二判別因子(DF2)累計貢獻率達到93%以上。DFA分析進一步驗證了PCA與雷達分析得出的結(jié)論。

圖3 不同提取方法處理后的檸檬草揮發(fā)性成分DFA圖
Fig.3 Dscriminate factorial analysis of volatile
components ofCymbopogoncitratusobtained by
different extracting methods

2.2 基于HS-SPME-GC-MS的成分分析

對HS-SPME-GS-MC分析檢測得到的數(shù)據(jù)進行分析(表2)，采用峰面積歸一化法確定揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量百分數(shù)。結(jié)合NIST11譜庫、Wiley275質(zhì)譜工作站進行比較檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻[2,25-27]，共分析得到24種揮發(fā)性化合物，分別為橙花醛、香葉醛、香葉醇、乙酸香葉酯、月桂烯、橙花醇、橙花叔醇、香葉酸、β-蒎烯、乙酸橙花酯、芳樟醇、苯乙酸香葉酯、香芹醇、β-石竹烯、甲酸香葉酯、左旋檸檬烯、對位-2-薄荷烯、香茅醇、甲基庚烯酮、馬鞭草烯醇、三氫順式α-古巴烯、石竹烯氧化物、棕櫚酸、松油醇。

表2 檸檬草中主要揮發(fā)性成分Table 2 Major volatile components of Cymbopogon citratus

注：“—”表示未檢出，本實驗數(shù)據(jù)為重復(fù)3次實驗后取平均值所得，誤差<1%。表中A、B、C、D分別代表4種不同處理方法得到的的樣品，其中A代表經(jīng)95 ℃加熱回流30 min處理后的樣品，B代表浸泡1 h后煮沸5 min的樣品，C代表直接沸水沖泡得到的樣品，D代表檸檬草精油。

通過對比4組樣品中主要揮發(fā)性物質(zhì)的種類、含量及進一步觀察氣相質(zhì)譜豐度與保留時間圖(圖4、圖5)后發(fā)現(xiàn)，通過沸水沖泡得到的檸檬草水提物中的主要揮發(fā)性成分與檸檬草精油中的主要揮發(fā)性物質(zhì)較為接近，該結(jié)果與電子鼻PCA及雷達圖分析的結(jié)果一致，通過不同提取方法得到的檸檬草水提物氣味指紋圖譜相似，即含有較多相同物質(zhì)。而檸檬草精油中各主成分的含量與文獻[28-30]中報道的有差異，這可能是由品種、產(chǎn)地、氣候條件及處理方法的不同引起的[31]。

3 結(jié)論

本研究證明，沸水沖泡后的檸檬草中主要揮發(fā)性成分與檸檬草精油最為接近，即檸檬草日常茶飲獲得的物質(zhì)與檸檬草精油中活性物質(zhì)大部分重疊，茶湯中揮發(fā)性成分與檸檬草精油中揮發(fā)性成分基本相似。本次研究還發(fā)現(xiàn)，電子鼻結(jié)合HS-SPME-GS-MC技術(shù)可以清晰、有選擇性、高效地分析、檢測檸檬草中的揮發(fā)性物質(zhì)。電子鼻結(jié)合頂空固相微萃取聯(lián)合氣相質(zhì)譜技術(shù)可以判別檸檬草中主要揮發(fā)性成分的差異并對檸檬草水提物中的揮發(fā)性成分進行定性定量分析，從而為檸檬草的分析、質(zhì)量判定及應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖4 樣品C豐度與保留時間圖
Fig.4 Abundance of volatile components of sample 3

圖5 樣品D豐度與保留時間圖
Fig.5 Abundance of volatile components of sample 4