魯氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter lwoffii UL產(chǎn)類胡蘿卜素的純化與鑒定及其抗氧化活性檢測(cè)

盛冉，孫志高，張震，方明，于奉生，張群琳，李甜

(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)

類胡蘿卜素是普遍存在于自然界的萜類化合物，在動(dòng)物和人體內(nèi)可發(fā)揮抗氧化，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，還具有抵抗紫外輻射功能，也是維生素A的前體物質(zhì)[1]。由于人體自身不能合成類胡蘿卜素，故必須從食物中獲取。目前，已有600多種類胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)，主要分為兩類：一是葉黃素類，具有含氧的功能性基團(tuán)，如蝦青素，葉黃素和玉米黃素等；二是胡蘿卜素類，由無(wú)官能團(tuán)的烴鏈構(gòu)成，如β-胡蘿卜素和番茄紅素等。目前，國(guó)內(nèi)外廣泛采用藻類發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，且其他微生物發(fā)酵類胡蘿卜素極具發(fā)展?jié)摿?，如三孢布拉氏霉發(fā)酵番茄紅素和β-胡蘿卜素[2]、粘紅酵母發(fā)酵蝦青素[3]等。但因微生物源類胡蘿卜素存在純度低、雜質(zhì)多等缺陷，所以其純化必不可少[4]。

魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)又稱洛菲不動(dòng)桿菌，是革蘭氏陰性、好氧、桿菌，廣泛分布于正常人體的皮膚和口咽，占人體正常菌群的20%～25%。不動(dòng)桿菌不需要復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)成分，能夠以多種物質(zhì)作為單一的能量來(lái)源，因此，不動(dòng)桿菌廣泛分布于土壤、水體以及干燥的環(huán)境中[2-5]。魯氏不動(dòng)桿菌發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素鮮有報(bào)道，因此探明其所產(chǎn)類胡蘿卜素種類極有必要性。

目前，微生物源類胡蘿卜素的純化主要通過(guò)薄層層析(TLC)、硅膠柱層析、制備柱色譜等手段分離純化類胡蘿卜素各組分。依據(jù)類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)特性采用紫外-可見(jiàn)光譜掃描、高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、傅里葉紅外光譜掃描、核磁共振氫譜以及核磁共振碳譜等方法進(jìn)行鑒定。

現(xiàn)代許多研究已證實(shí)癌癥、衰老和大多數(shù)疾病的產(chǎn)生都與體內(nèi)過(guò)量自由基的產(chǎn)生相關(guān)，所以抗氧化的研究具有很大潛力[5-6]?？寡趸芯坑畜w內(nèi)和體外兩大類方法，通常廣泛采用的是體外抗氧化測(cè)定方法[7-8]。本試驗(yàn)先用TLC和柱層析對(duì)類胡蘿卜素進(jìn)行純化，再將純化后的色素利用HPLC、1H-NMR、FRIT和Q-TOF-HPLC-MS-MS進(jìn)行鑒定。類胡蘿卜素生理活性的發(fā)揮依賴其抗氧化活性，故本試驗(yàn)采用ABTS、DPPH、FRAP三種方法對(duì)色素粗提液和純化后的組分1、組分2進(jìn)行了抗氧化活性的評(píng)價(jià)和對(duì)比。以期為魯氏不動(dòng)桿菌(AcinetobacterlwoffiiUL)類胡蘿卜素在食品、醫(yī)藥及化工產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

魯氏不動(dòng)桿菌UL(AcinetobacterlwoffiiUL)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M 2017776。

R2A液體培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、魚蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、K2HPO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、丙酮酸鈉0.3 g，加蒸餾水至1 L，調(diào)節(jié)pH值至6.5。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試驗(yàn)試劑

柱層析硅膠200～300目，青島海洋化工廠；薄層層析板F254，德國(guó)默克；DPPH、TPTZ、ABTS、乙腈，色譜純，Sigma公司；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚(沸程60～90℃)、正庚烷、二氯甲烷、醋酸，純度均為分析純，購(gòu)自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；溴化鉀、過(guò)硫酸鉀、醋酸鈉，成都市科龍化工試劑廠。酵母粉、胰蛋白胨、魚蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O，成都市科龍化工試劑廠；丙酮酸鈉，Bio Basic Inc。

1.2.2 試驗(yàn)儀器

臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(L-550)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(SPX-150-Z)，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F)，蘇泰集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1901)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平(FAZO04B)，上海精科儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50S Ⅱ)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R1001-VN)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(SY-5000)，上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;恒流泵(BT100-2J)，保定蘭格；電腦全自動(dòng)部分收集器(DBS-100)，上海滬西儀器分析廠有限公司；核磁共振波譜儀(AVANCEⅢ-400MHz)，瑞士布魯克；傅里葉光譜掃描儀(Prestige-21)，日本島津公司；高效液相色譜儀(UltiMate3000)，戴安中國(guó)有限公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(H-CLASS,G2XS)，Waters；氮吹儀(TTL-DCI)，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 類胡蘿卜素發(fā)酵液的制備

將0.4%種子發(fā)酵液接種于100 mL R2A培養(yǎng)基中，調(diào)pH值至6.5、搖床轉(zhuǎn)速100 r/min、溫度28 ℃，培養(yǎng)96 h。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取

采用有機(jī)溶劑提取法，1 L發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min后搜集菌體沉淀。以90%乙醇為提取劑、料液比7∶50(g∶mL)、室溫下提取30 min后，8 000 r/min離心10 min，以獲得上清色素提取液。隨后采用減壓真空法將紅色素在45 ℃的水浴中濃縮至干，再將色素復(fù)溶于4 mL甲醇溶液中，以8 000 r/min離心10 min以近一步除去菌體，從而得到色素粗提液。

1.3.3 類胡蘿卜素的純化

1.3.3.1 薄層層析(TLC)

將色素粗提液點(diǎn)樣于薄層層析板上，后將其放置于裝有展開劑的層析缸中進(jìn)行展開，當(dāng)展開劑展開至距層析板2 cm處取出，此時(shí)樣品組分會(huì)因移動(dòng)速度不同而發(fā)生分離[9]。由于樣品本身有顏色故無(wú)需噴顯色劑可直接通過(guò)顏色判斷分離情況，最終用比移值Rf來(lái)表示被分離物質(zhì)在薄層板上的位置，Rf=物質(zhì)本身移動(dòng)距離/溶劑前沿移動(dòng)距離。展開劑體系的選擇如表1所示。

表1 類胡蘿卜素粗提液TLC展開劑的選擇Table 1 Selection of TLC expansion agent for carotenoidcrude extract

1.3.3.2 柱層析

稱取50 g柱層析硅膠于110 ℃活化2 h，加入展開體系中極性較低的溶劑，體積約為干硅膠體積的1倍，用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬蠼莩恋?2 h，再用玻璃棒混合成硅膠勻漿裝入60×3 cm的層析柱中，利用層析系統(tǒng)中低極性溶劑平衡柱子，待柱中硅膠沉淀緊實(shí)、且無(wú)氣泡后再用層析溶劑平衡柱子1～2個(gè)體積，最后進(jìn)行上樣(4 mL類胡蘿卜素粗提液)，流速1 mL/min，以自動(dòng)接收器每4 min接收1管，最后以顏色區(qū)別各洗脫液，以組分管數(shù)為X、吸光度值OD478為Y軸作圖，以及對(duì)含色素管進(jìn)行TLC檢驗(yàn)來(lái)判斷其是否良好分開[10]。依據(jù)TLC所選展開劑進(jìn)行柱層析洗脫劑的選擇，洗脫劑試驗(yàn)體系如表2所示。

1.3.4 類胡蘿卜素的鑒定

1.3.4.1 類胡蘿卜素溶解性

取少量被純化后氮吹干的類胡蘿卜素固體，分別溶于1 mL的水、甲醇、乙醇、丙酮、正庚烷、石油醚、乙酸乙酯中，觀察其溶解情況。

表2 類胡蘿卜素粗提液柱層析洗脫劑的選擇Table 2 Selection of column chromatograph eluent forcarotenoid crude extract

1.3.4.2 HPLC

經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定HPLC條件為：PDA檢測(cè)器、反向C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、流動(dòng)相為A(甲醇)∶B(水)=95∶5(V∶V)；檢測(cè)波長(zhǎng)478 nm；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4.3 傅里葉紅外光譜掃描

將KBr與氮吹干的10 mg樣品進(jìn)行混合壓片，并以KBr空白壓片作為參比進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描。

1.3.4.4 核磁共振氫譜

稱取5 mg樣品溶解于CDCL3，并立即轉(zhuǎn)移至核磁管中，將核磁共振管擦拭干凈，置于核磁共振波譜儀中進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.5 Q-TOF-HPLC-MS-MS

色譜儀WATERS UPLC-Q-TOF-MS，檢測(cè)器ACQUITY的ESI的正離子模式，分析柱：ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相A水(0.1%甲酸)∶B乙腈，梯度洗脫，0～0.5 min 40%B、0.5～3.0 min 50%B、3～4.5 min 55%B、4.5～8.5 min 70%B、8.5～13.8 min 100%B，進(jìn)樣量1 μL，流速0.2 mL/min，毛細(xì)管電壓3 000 V，錐孔電壓40 V，脫溶劑氣溫度400 ℃，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣體流量50 L/h，質(zhì)量范圍m/z100～1 000。

1.3.5 類胡蘿卜素抗氧化活性檢測(cè)

1.3.5.1 ABTS法

1.3.5.2 FRAP法

取0.1 mL 20 μg/mL的色素-80%甲醇溶液加入4.9 mL FRAP試劑，避光反應(yīng)10 min后在波長(zhǎng)593 nm測(cè)定吸光度值，空白加0.1 mL 80%甲醇替代提取液，吸光度值越大表示抗氧化能力越強(qiáng)。FRAP溶液配制:0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=3.6)∶10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L HCl)∶20 mmol/L FeCl3.6H2O=10∶1∶1(V∶V∶V)[11]。

1.3.5.3 DPPH法

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，將平行3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，以O(shè)rigin 8.6專業(yè)函數(shù)繪圖軟件繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素的純化

薄層層析(TLC)是根據(jù)相似相溶原理發(fā)展起來(lái)的色譜分離技術(shù)，通過(guò)某一物質(zhì)的吸附、溶解或親和性能的不同，隨著展開劑的不斷遷移混合物在不斷吸附和分配等作用下而分離，是快速分離和定性分離少量物質(zhì)的重要技術(shù)[12]。一般認(rèn)為合適的TLC展開系統(tǒng)是被分離物質(zhì)的Rf不宜過(guò)大或過(guò)小，且展開后可較好判斷各成分的分離情況。

從表3可知，以正庚烷和丙酮為展開劑時(shí)效果較好，當(dāng)配比為7∶3、6∶4、1∶1、4∶6時(shí)色素均可分離為2條條帶，其中當(dāng)配比為1∶1時(shí)Rf分別是0.428和0.500，更適宜作展開劑；當(dāng)展開劑為正己烷∶丙酮=6∶4時(shí)，Rf分別是0.692和0.615，但2條色素帶呈現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，當(dāng)其配比為3∶7時(shí)，Rf值過(guò)大不適合作為展開體系；二氯甲烷∶甲醇系統(tǒng)雖也有合適的Rf值，但條帶變?yōu)辄S色且極易消失。因此，綜合選取正庚烷∶丙酮=1∶1為展開劑，Rf分別為0.428和0.500(如圖1)。

表3 TCL展開劑篩選結(jié)果表Table 3 TCL expansion agent screening result

圖1 TLC展開圖
Fig.1 TLC expansion diagram

硅膠層析法是根據(jù)不同物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而將其分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過(guò)程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過(guò)程[13]。柱層析的洗脫劑是依據(jù)薄層層析展開劑的配比和極性進(jìn)行篩選，由表4可知，正庚烷∶丙酮=1∶1的體系可將類胡蘿卜素分為2條條帶，由圖2可知色素形成2個(gè)峰，23～31管和36～53管，其中36～53管之間的色素含量多，在波長(zhǎng)478 nm其吸光度值最大，可以達(dá)到1.0左右，經(jīng)過(guò)TLC驗(yàn)證可以看出2種色素組分被良好地分開了(如圖3)。

表4 類胡蘿卜素柱層析洗脫劑篩選結(jié)果Table 4 Screening results of carotenoid columnchromatography eluant

圖2 類胡蘿卜素柱層析洗脫液紫外-可見(jiàn)
光譜檢測(cè)值
Fig.2 Carotenoid column chromatograph eluent UV
visible spectrum detection value

圖3 柱層析后TLC展開圖
Fig.3 TLC expansion after column chromatography

2.2 類胡蘿卜素組分的鑒定

類胡蘿卜素粗提液經(jīng)純化后獲得2種組分，即組分1和組分2。由于組分1含量較少，因此只對(duì)組分2進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.2.1 純化后類胡蘿卜素溶解性

從表5可知，該色素不溶于水、微溶于丙酮、甲醇、乙醇，易溶于正庚烷、石油醚、乙酸乙酯，表明該色素為脂溶性色素，且極性相對(duì)較小。這與黃水英報(bào)道的雨生紅球藻中蝦青素溶解性基本一致[14]。

表5 純化后類胡蘿卜素溶解性表Table 5 Purified carotenoid solubility

注：“-”表示不溶解；“+”表示易溶解。

2.2.2 純化后類胡蘿卜素HPLC檢測(cè)

由圖4可知，雖已對(duì)色素進(jìn)行純化處理，但類胡蘿卜素中依舊至少存在4種成分，4種類胡蘿卜素的極性相差不大，應(yīng)該為結(jié)構(gòu)類似的一類物質(zhì)。造成這一現(xiàn)象的原因，一方面可能是幾種極性和結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)構(gòu)成了這一組分，另一方面可能是類胡蘿卜素不穩(wěn)定而產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，類胡蘿卜素分子中含有很長(zhǎng)的不飽和雙鍵，末端可能還存在不飽和的酮基或羥基，故分子較為活潑易氧化分解[15]。

圖4 純化后類胡蘿卜素的HPLC檢測(cè)圖
Fig.4 HPLC detection of carotenoid after purification

2.2.3 純化后類胡蘿卜素的傅里葉紅外光譜掃描

圖5 純化后類胡蘿卜素的傅里葉紅外光譜掃描圖
Fig.5 Fourier infrared spectrogram of carotenoid after purification

2.2.4 純化后類胡蘿卜素的核磁共振氫譜

圖6 純化后色素的核磁共振氫譜檢測(cè)圖
Fig.6 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum of
purified pigment after purification

2.2.5 純化后類胡蘿卜素的UPLC-Q-TOF-MS-MS檢測(cè)

依據(jù)UPLC-Q-TOF-MS的色譜圖選取出峰較高、吸光度值為478 nm的色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果如圖7所示。

由圖7-A可知，其中一種成分(即成分1)的一級(jí)質(zhì)譜MS出現(xiàn)了m/z615.583 1、309.299 5、308.300 1的特征離子，其中m/z615.583 1為基峰，推測(cè)m/z615.583 1離子為[M+Na]+的離子峰，即M為592，而沒(méi)有看到其準(zhǔn)分子離子峰m/z593[M+H]+。二級(jí)質(zhì)譜MS-MS出現(xiàn)了m/z309.295 9、308.296 5等主要的離子碎片峰，m/z309.295 9離子峰來(lái)源可能是該物質(zhì)裂解產(chǎn)生的C21H25O2·碎片，m/z308.300 1是其失去1個(gè)H而產(chǎn)生的碎片。由圖7-B可知，另一種組分(即成分2)的基峰為m/z619.614 6[M+Na]+，即該物質(zhì)的分子量M為596，m/z310.311 3為該物質(zhì)裂解產(chǎn)生的C21H26O2·碎片。結(jié)合溶解性、最大吸收波長(zhǎng)、FRIT和1H-NMR，可知組分2的物質(zhì)中含有多烯長(zhǎng)鏈、多個(gè)甲基和亞甲基、苯環(huán)、羰基等特征結(jié)構(gòu)，查閱文獻(xiàn)可知，圖7-A物質(zhì)的分子式可能是C40H48O4，可能為蝦紅素(astacen)，其結(jié)構(gòu)式如圖8所示。圖7-B的分子式為C40H52O4，可能為蝦青素(astaxanthin)，結(jié)構(gòu)式如圖9所示[16]。

據(jù)程紅艷等[17]研究表明，采用反相高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法(RP-HPLC-DAD-ESI-MS)測(cè)定含氧類胡蘿卜素葉黃素分子量和裂解規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，其電噴霧一級(jí)質(zhì)譜特征離子為m/z589、306，其中m/z589 為其基峰，根據(jù)質(zhì)量數(shù)確定m/z589 離子是[M+Na-2H]+離子峰，而葉黃素分子離子峰m/z568[M]+信號(hào)十分微弱，沒(méi)有看到準(zhǔn)分子離子峰m/z569[M+H]+，說(shuō)明采用電噴霧質(zhì)譜分析葉黃素不易產(chǎn)生分子離子峰和準(zhǔn)分子離子峰，易產(chǎn)生[M+Na-2H]+離子峰。另外，二級(jí)質(zhì)譜特征離子確定m/z306([M+Na -C20H28O -H]+)峰為m/z589([M+Na-2H]+)離子峰的碎片峰。本試驗(yàn)所得的含氧類胡蘿卜素在電噴霧電離質(zhì)譜(ESI)下也基本符合RITA FRASSANITO所報(bào)道的蝦青素裂解規(guī)律[16]和程紅艷報(bào)道的葉黃素裂解規(guī)律[17]。

A-組分二中成分1；B-組分二中成分2圖7 純化后類胡蘿卜素的UPLC-Q-TOF-MS-MS檢測(cè)圖Fig.7 UPLC-Q-TOF-MS-MS detection of carotenoids after purification

圖8 Astacen的結(jié)構(gòu)式
Fig.8 Structure of Astacen

圖9 蝦青素的結(jié)構(gòu)式
Fig.9 Structure of astaxanthin

2.3 類胡蘿卜素抗氧化活性的檢測(cè)

體內(nèi)抗氧化的研究即動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不僅昂貴、耗時(shí)，且不適合初期大量篩選，但體外抗氧化測(cè)定具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)而被廣泛使用[11]。體外評(píng)價(jià)抗氧化活性時(shí)若僅用1種方法不具有代表性和說(shuō)服力，而常常選用3種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)[18]。因此，本文選取ABTS(評(píng)價(jià)自由基清除率)、FRAP(評(píng)價(jià)總還原力)、DPPH(評(píng)價(jià)自由基清除率)3種方法進(jìn)行色素抗氧化活性評(píng)價(jià)，ABTS和DPPH方法中吸光度值越小抗氧化活性越強(qiáng)，但FRAP法是吸光度值越大抗氧化活性越強(qiáng)。從表7可以看出類胡蘿卜素粗提液以ABTS法和DPPH測(cè)定的吸光度值(0.300 5和1.174 0)均低于CK(0.627 0和1.324 5)，自由基清除率分別為55.32%和11.36%，表明色素具有抗氧化活性；FRAP法檢測(cè)色素粗提液的吸光度值(0.210 0)高于CK(0.085 0)，也表明色素具有抗氧化活性。

表7 類胡蘿卜素抗氧化活性檢測(cè)Table 7 Carotenoid antioxidant activity detection

因此。經(jīng)過(guò)3種方法檢測(cè)評(píng)價(jià)類胡蘿卜素粗提液均具有抗氧化性。由表7可知，除ABTS法測(cè)定外，經(jīng)純化后的類胡蘿卜素抗氧化活性顯著提高，以FRAP法評(píng)價(jià)時(shí)，類胡蘿卜素組分1抗氧化活性較類胡蘿卜素為粗提液的7.23倍，類胡蘿卜素組分2抗氧化活性為粗提液的7.79倍；以DPPH法評(píng)價(jià)時(shí)，類胡蘿卜素組分1抗氧化活性為粗提液的5.52倍，類胡蘿卜素組分2抗氧化活性為粗提液的5.48倍，表明經(jīng)過(guò)柱層析純化后類胡蘿卜素的純度大大提高，其抗氧化活性也顯著提高。據(jù)報(bào)道，由于蝦青素結(jié)構(gòu)中存在很長(zhǎng)的不飽和雙鍵，末端還存在不飽和的酮基和羥基，因而具有較強(qiáng)的抗氧化活性[15]。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以魯氏不動(dòng)桿菌UL所產(chǎn)類胡蘿卜素為原料，采用TLC和柱層析對(duì)類胡蘿卜素粗提液進(jìn)行純化，試驗(yàn)得出TLC最佳展開條件為正庚烷∶丙酮=1∶1，得到2條紅色條帶，其Rf分別為0.428和0.500；柱層析最佳的洗脫條件為流速1 mL/min、上樣量4 mL、洗脫劑正庚烷∶丙酮=1∶1、每隔4 min接收1管，該體系可將類胡蘿卜素分為2種組分，分別為組分1和組分2。將純化后的組分2進(jìn)行溶解性、HPLC、FRIT、1H-NMR以及UPLC-Q-TOF-MS-MS等檢測(cè)和分析，結(jié)果表明組分2中含有多烯長(zhǎng)鏈、多個(gè)甲基和亞甲基、苯環(huán)、羰基等類胡蘿卜素特征結(jié)構(gòu)，查閱文獻(xiàn)推斷其是蝦紅素(astacen)，分子式C40H48O4，分子量592，以及含量相對(duì)較少的蝦青素，分子式C40H52O4，分子量596。試驗(yàn)采用ABTS、FRAP、DPPH 3種方法評(píng)價(jià)了類胡蘿卜素粗提液和純化后類胡蘿卜素組分1、組分2的抗氧化活性，試驗(yàn)結(jié)果表明類胡蘿卜素粗提液具有抗氧化性，純化后類胡蘿卜素的抗氧化活性顯著提高。

本試驗(yàn)雖已對(duì)類胡蘿卜素進(jìn)行了純化，但純度還能進(jìn)一步提高。下一步研究可采用制備柱色譜對(duì)類胡蘿卜素進(jìn)行純化，以獲得純度更高的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，若能實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)，不僅能為類胡蘿卜素的應(yīng)用提供新的思路和前提條件，而且能夠增加類胡蘿卜素的應(yīng)用價(jià)值，更好地創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益。因此，認(rèn)為魯氏不動(dòng)桿菌(AcinetobacterlwoffiiUL)產(chǎn)類胡蘿卜素能否或如何應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)亟待研究。