Streptococcus thermophilus S10復(fù)合Lactobacillus plantarum P-8在發(fā)酵豆乳中的應(yīng)用

郭帥，韓之皓，黃天，鄭巖，王月嬌，白梅，王記成，孫天松，張和平*

1 (乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué))，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)2 (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué))，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素[1]，在《中國居民膳食指南(2016版)》中建議經(jīng)常食用大豆制品[2]。發(fā)酵豆乳是豆制品的重要組成部分，是在豆?jié){基礎(chǔ)上接種乳酸菌發(fā)酵而成的植物性發(fā)酵食品。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵作用，發(fā)酵豆乳可提高脂質(zhì)代謝，不會引起肥胖[3]；發(fā)酵后的大豆蛋白質(zhì)更容易消化吸收，且能提高機體免疫力并有效降低血清中總膽固醇含量[4]；被分解的大豆低聚糖能促進益生菌增殖，保持腸道健康[5]；此外，還可有效降解大豆中的抗營養(yǎng)因子和消除豆腥味[6]。本研究菌種StreptococcusthermophilusS10(S.thermophilusS10)是在乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫的406株S.thermophilus中篩選得到的1株具有良好發(fā)酵大豆乳特性和弱化后酸能力較好的S.thermophilus[7]。LactobacillusplantarumP-8(L.plantarumP-8)是本實驗室于2005年分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發(fā)酵酸牛乳樣品中的1株具有優(yōu)良益生特性的L.plantarum，在消化系統(tǒng)中具有優(yōu)異的耐受胃酸、腸液和膽鹽能力[8-9]，在單菌發(fā)酵大豆乳實驗中證明可顯著提高其活性大豆異黃酮含量[10]。本研究應(yīng)用S10+P-8發(fā)酵豆乳，為開發(fā)一款符合現(xiàn)代生活要求的新型產(chǎn)品提供理論研究基礎(chǔ)和一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養(yǎng)基

本研究所用S.thermophilusS10和L.plantarumP-8直投式發(fā)酵劑由乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫提供，商業(yè)發(fā)酵劑A和B分別購自科漢森(中國)有限公司、丹尼斯克(中國)有限公司；所用培養(yǎng)基為合成MRS-V(萬古霉素 10 mg/L)固體培養(yǎng)基和合成ST固體培養(yǎng)基。

1.1.2 主要實驗材料

全脂大豆粉，蛋白質(zhì)含量≥39%，黑龍江農(nóng)墾龍王食品有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

NSC-II A-1200型無菌工作臺；雷磁PHS-3C 型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；SRH 60-70型高壓均質(zhì)機，上海申鹿均質(zhì)機有限公司；Brookfield DV-1型黏度計，上海君翼儀器設(shè)備有限公司；SA 402B型味覺感應(yīng)系統(tǒng)，日本Insent公司；Waters Acquity UPLC-QTOF MS超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵豆乳樣品制備

將全脂豆粉(6.6%)與蔗糖(8%)混合后加入到60 ℃蒸餾水(85.4%)攪拌均勻，然后于65℃、30 MPa條件下均質(zhì)，95℃殺菌5 min，冷卻至(42±0.5)℃接種發(fā)酵劑[6]。樣品置于42 ℃恒溫發(fā)酵至pH接近4.50后，轉(zhuǎn)至4℃過夜后熟，4℃貯藏28 d。發(fā)酵過程中每隔2 h取樣檢測，貯藏期間每隔7 d取樣檢測；接種量依據(jù)商業(yè)發(fā)酵劑產(chǎn)品說明0.03 g‰添加，實驗組按照S.thermophilusS10∶L.plantarumP8=1 000∶1添加，其中S.thermophilusS10添加量為2×106CFU/mL。

1.2.2 實驗組樣品活菌數(shù)測定

實驗組S.thermophilusS10采用ST固體培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)[11]；L.plantarumP8采用固體培養(yǎng)基MRS-V(萬古霉素10 mg/L)進行選擇培養(yǎng)[12]。37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)(72±6)h，記錄菌落數(shù)變化。

1.2.3 發(fā)酵豆乳樣品酸度測定

pH值測定：采用雷磁PHS-3C 型pH計直接測定；

滴定酸度測定：發(fā)酵豆乳的滴定酸度按照國家標準GB5009. 239 — 2016中規(guī)定的“酚酞指示劑法”進行檢測[13]。

1.2.4 發(fā)酵豆乳樣品黏度、持水性測定

黏度測定：發(fā)酵豆乳樣品放至室溫后，采用Brookfield DV-1型黏度儀4#轉(zhuǎn)子進行測定，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。

持水性測定：準確稱取發(fā)酵豆乳樣品20.00 g，置于有濾紙的漏斗中，室溫放置90 min后收集濾液并稱重[14]。計算方法如下：

(1)

1.2.5 發(fā)酵豆乳樣品游離大豆異黃酮含量測定

樣品處理：取4 mL發(fā)酵豆乳上清液于10 mL EP管中，加4 mL乙醇，加HCl至濃度為1 mol/L，混勻，80℃孵育60 min，9000×g高速離心10 min，取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾于樣品瓶中備用，色譜條件按照米智慧等[15]進行設(shè)定。

1.2.6 發(fā)酵豆乳樣品質(zhì)構(gòu)特性測定[16]

將樣品溫度恢復(fù)至室溫，應(yīng)用質(zhì)構(gòu)分析儀測定其質(zhì)構(gòu)特性，檢測指標有堅實度、稠度、黏性、黏滯指數(shù)。TPA測定參數(shù)如下：測定前探頭速度、測定時探頭速度、測定后探頭速度均為1.00 mm/s；測定距離20 mm；探頭柱型AEC，盤徑35 mm；感應(yīng)力Auto-5 g；數(shù)據(jù)攫取速度200 pps。

1.2.7 發(fā)酵豆乳樣品基本味覺特征評價

將后熟完成且恢復(fù)常溫的樣品3 000×g離心10 min后過濾上清液，所得濾液于4℃、8 000×g離心10 min，除去上層油脂后留濾液備用[17]。樣品測定具體操作以KOBAYASHI Y等[18]進行樣品的測定。

1.2.8 發(fā)酵豆乳樣品感官品鑒

貯藏期間，發(fā)酵豆乳樣品每7 d進行1次感官品鑒。感官品鑒小組由5名女性、5名男性共10名品鑒人員組成，10名品鑒人員經(jīng)常飲用發(fā)酵乳(豆乳和牛乳)，并接受2次時間為2 h的感官鑒評培訓(xùn)[19]。評鑒指標有表觀指標、氣味指標、風味指標和質(zhì)地指標，評分采用100分制[20]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

實驗至少重復(fù)3次，各指標均為3組平行，結(jié)果表示為(X±s。采用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，2組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本T檢驗(independent-samples T-test)進行分析，顯著性水平設(shè)定為0.05；3組或多于3組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan’s法進行兩兩比較分析，顯著性水平同樣設(shè)定為0.05。作圖采用Origin lab 2017軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗組樣品在貯藏期間活菌數(shù)變化情況

本實驗研究內(nèi)容為活菌型益生菌發(fā)酵豆乳，歐盟規(guī)定在貨架期內(nèi)益生菌產(chǎn)品益生菌活菌數(shù)須保持在106CFU/mL以上[21]。將4 ℃貯藏的樣品進行發(fā)酵完成、后熟、7、14、21和28 d活菌數(shù)統(tǒng)計，作為衡量本樣品貯藏穩(wěn)定性的重要評定標準。

表1 實驗組樣品在貯藏期間活菌數(shù)變化情況Table 1 Changes of viable bacterial counts of fermentedsoymilk experimental group with storage time

注：不同小寫字母代表差異顯著性，P<0.05。

由表1可知：貯藏期間，S.thermophilusS10活菌數(shù)在14 d后有下降趨勢(P<0.05)；益生菌L.plantarumP-8活菌數(shù)在21 d時有下降趨勢(P<0.05)；貯藏結(jié)束時，S.thermophilusS10維持在4.00×107CFU/mL以上；益生菌L.plantarumP-8的活菌數(shù)維持在1.0×109CFU/mL以上。本實驗證明應(yīng)用S10+P-8發(fā)酵豆乳，益生菌L.plantarumP-8具有很好的貯藏穩(wěn)定性。

2.2 發(fā)酵豆乳在發(fā)酵、貯藏期間酸度變化情況

由圖1可知：添加不同發(fā)酵劑分別發(fā)酵豆乳，發(fā)酵期間酸度均有顯著變化(P<0.05)。發(fā)酵過程中，添加發(fā)酵劑A的樣品在0～4 h期間pH值、滴定酸度變化顯著(P<0.05)；添加S10+P-8、發(fā)酵劑B的樣品在2～6 h期間pH值、滴定酸度變化顯著(P<0.05)；3種樣品到達發(fā)酵終點所需時間約9 h，pH分別是4.48、4.48和4.47，滴定酸度分別是60.64、58.40和58.21 °T，差異不顯著。在貯藏期間，3種發(fā)酵豆乳樣品酸度有顯著變化(P<0.05)。貯藏結(jié)束時pH在4.30左右，組間差異不顯著，滴定酸度在74.00 °T以下，S10+P-8組與發(fā)酵劑A組之間差異不顯著，分別是68.78 °T和68.51 °T，低于發(fā)酵劑B組，差異顯著(P<0.05)。發(fā)酵豆乳在貯藏期間酸度保持是體現(xiàn)高品質(zhì)的重要標準，一般商業(yè)發(fā)酵乳的pH值4.2～4.4[22]。

圖1 發(fā)酵過程及貯藏期間3種發(fā)酵豆乳樣品
酸度變化情況
Fig.1 The acidity of three groups of fermented soymilk
samples during fermentation and storage period

2.3 發(fā)酵豆乳在發(fā)酵、貯藏期間黏度變化情況

添加不同發(fā)酵劑分別發(fā)酵豆乳，發(fā)酵過程和貯藏期間黏度測定結(jié)果如圖2所示：發(fā)酵過程中各組樣品黏度均顯著升高(P<0.05)，發(fā)酵劑A組樣品約4 h達到凝乳狀態(tài)，與S10+P-8組和發(fā)酵劑B組樣品有顯著差異(P<0.05)；S10+P-8組和發(fā)酵劑B組樣品約6 h凝乳。發(fā)酵結(jié)束時，樣品組間黏度無顯著差異。有研究者認為黏度無顯著差異可能是由于菌體增殖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵豆乳中乳酸的含量增加到足夠濃度時，大豆蛋白凝固形成酸凝膠使黏度迅速增加，使菌體代謝受到抑制，乳酸的生成速度下降，限制了黏度繼續(xù)上升，致使最終黏度保持相對穩(wěn)定狀態(tài)[23]。3組樣品經(jīng)4 ℃過夜后熟黏度顯著升高，其中S10+P-8組黏度較高，差異顯著(P<0.05)。這是由于完成發(fā)酵后乳酸菌依舊保持較高活力活性，胞外多糖繼續(xù)積累，相比之前黏度變化顯著(P<0.05)。在4 ℃、28 d貯藏期間，組內(nèi)黏度變化差異不顯著，其中S10+P-8組黏度較高，差異顯著(P<0.05)，因?qū)嶒灲ML.plantarumP-8一直保持較高活菌數(shù)，乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸，大豆蛋白凝固作用形成酸凝膠使黏度較高。

圖2 發(fā)酵過程及貯藏期間3種發(fā)酵豆乳樣品
黏度變化情況
Fig.2 The viscosity of three groups of fermented soymilk
samples during fermented and storage period

2.4 發(fā)酵豆乳樣品在發(fā)酵過程、貯藏期間持水性變化情況

發(fā)酵豆乳持水性變化是由蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠狀態(tài)所形成的，蛋白質(zhì)是將流動性較好的豆乳轉(zhuǎn)化為半固態(tài)發(fā)酵豆乳的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)。接種發(fā)酵劑不同，乳酸菌代謝產(chǎn)物也會有差異，致使蛋白質(zhì)會發(fā)生不同程度地變性凝集，進而影響發(fā)酵豆乳持水性[24]。

圖3 發(fā)酵過程及貯藏期間3種發(fā)酵豆乳樣品
持水性變化情況
Fig.3 The water holding capacity of three groups of ferm-
ented soymilk samples during fermented and storage period

由圖3可知：3種發(fā)酵豆乳樣品在發(fā)酵過程中持水性均有顯著變化(P<0.05)。發(fā)酵結(jié)束時持水性較低，后熟完成后持水性顯著增強(P<0.05)；3組樣品在14 d前持水性呈一直上升趨勢，之后有小幅下降。貯藏期間S10+P-8組持水性較高，與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)。這可能與樣品在貯藏期間活菌數(shù)、pH值和黏度變化有關(guān)，有利于產(chǎn)品貯藏及風味保留。

2.5 發(fā)酵豆乳樣品大豆異黃酮含量變化情況

關(guān)于大豆異黃酮成分，一般認為大豆苷(daidzin)、大豆素(daidzein)、染料木苷(genistin)、染料木素(genistein)是大豆異黃酮的主要成分，大豆黃苷(glycitin)和大豆黃素(glycitein)生理活性的報道較少，其中大豆苷(daidzin)、大豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)屬于糖苷型大豆異黃酮；大豆素(daidzein)、大豆黃素(glycitein)、染料木素(genistein)屬于游離型大豆異黃酮[25]。在4 ℃貯藏期間大豆異黃酮含量變化不顯著，具有一定穩(wěn)定性，所以本實驗選擇原豆乳、發(fā)酵結(jié)束和后熟完成進行大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素含量測定。

表2 三種發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮含量變化情況 單位：μg/mL

注：數(shù)據(jù)肩不同大寫字母代表組間變化差異性，不同小寫字母代表組內(nèi)變化差異性。P<0.05。下同。

由表2可知：發(fā)酵劑B組樣品4種大豆異黃酮含量變化不顯著。S10+P-8組和發(fā)酵劑A組樣品中4種大豆異黃酮含量變化顯著(P<0.05)：大豆苷和大豆素含量測定結(jié)果表明，S10+P-8組與發(fā)酵劑A組相比變化量更大，差異顯著(P<0.05)。染料木苷和染料木素含量測定結(jié)果表明，S10+P-8組與發(fā)酵劑A組樣品相比差異不顯著。BAO等[10]研究表明，接種L.plantarumP-8于豆乳中，經(jīng)發(fā)酵作用可促使無生物活性異黃酮轉(zhuǎn)化為有生物活性的異黃酮，這可能是實驗組比對照組樣品的活性異黃酮轉(zhuǎn)化量更大原因。

2.6 發(fā)酵豆乳樣品質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果

利用質(zhì)構(gòu)儀檢測3種樣品在貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性變化，結(jié)果如表3所示：在貯藏期間，對照組樣品的4種質(zhì)構(gòu)指標變化差異不顯著；S10+P-8組樣品的稠度和黏性與對照組相比具有更高的數(shù)值，差異顯著(P<0.05)，其中稠度在1～14 d略有上升，之后有小幅下降。這可能與樣品活菌數(shù)和黏度變化有關(guān)；S10+P-8組樣品其余3種質(zhì)構(gòu)指標在貯藏期間變化不顯著。

表3 貯藏期間3種發(fā)酵豆乳樣品質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果Table 3 The texture parameters of three groups offermented soymilk samples during fermented andstorage period

2.7 發(fā)酵豆乳樣品基本味覺特征總體評價

國外已開始應(yīng)用電子舌技術(shù)進行酸奶品質(zhì)評價及在線生產(chǎn)監(jiān)測，國內(nèi)相關(guān)研究仍處于起步階段[26]。本實驗應(yīng)用電子舌系統(tǒng)檢測經(jīng)4℃過夜后熟的發(fā)酵豆乳樣品的6種基本滋味和3種回味，各滋味指標相對強度分析結(jié)果如圖4所示：3種發(fā)酵豆乳樣品的基本滋味差異較小，KOBAYASHI等[27]研究發(fā)現(xiàn)，使用SA 402B電子舌對食品進行測定時，若2個樣品在某1個滋味指標的相對強度值之差<1，則其差異通過感官品鑒方法不能識別。方差分析結(jié)果如表4所示：3種發(fā)酵豆乳樣品的鮮味和3個回味無顯著差異；發(fā)酵劑B組樣品苦味與其余2組有顯著差異(P<0.05)，有更高滋味強度；S10+P-8組樣品澀味和咸味與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，滋味強度更弱；S10+P-8組樣品酸味和甜味與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，有更高滋味強度。

圖4 三種發(fā)酵豆乳樣品各滋味指標相對強度值的
箱形圖(n=18)
Fig.4 The box plot of relative intensity of each taste index
in three groups of fermented soymilk samples (n=18)

表4三種發(fā)酵豆乳樣品各滋味指標相對強度差異性分析
Table4Significantanalysisofeachindexofthreegroups
offermentedsoymilksampleswithstoragetime

項目S10+P-8商業(yè)發(fā)酵劑A商業(yè)發(fā)酵劑B酸味-12.38±0.04a-12.91±0.23b-12.83±0.11b苦味0.10±0.01a0.10±0.01a0.40±0.03b澀味0.77±0.01b1.01±0.01a1.04±0.01a咸味-1.29±0.01a-1.49±0.01b-1.48±0.00b甜味5.51±0.07a5.35±0.07b4.09±0.01c鮮味5.71±0.01a5.76±0.01a5.73±0.00a回味-A0.26±0.01a0.24±0.01a0.25±0.01a回味-B-0.34±0.01a-0.36±0.01a-0.33±0.01a豐富度5.01±0.03a5.08±0.01a5.04±0.01a

注：同行不同字母表示差異顯著，P<0.05。

2.8 發(fā)酵豆乳樣品感官品鑒

取發(fā)酵完成、后熟、7、14、21、28 d時的3種發(fā)酵豆乳樣品，進行感官品鑒，評分結(jié)果如圖5所示。

圖5 貯藏期間3種發(fā)酵豆乳樣品感官品鑒得分情況
Fig.5 The comprehensive score of three fermented soymilk
samples in sensory quality evaluated during storage period

在4 ℃、28 d貯藏期間，各組樣品得分變化差異不顯著，但樣品組間得分存在差異(P<0.05)。其中S10+P-8組和發(fā)酵劑A組樣品差異不顯著，高于發(fā)酵劑B組。S10+P-8組樣品在貯藏期間黏度較高，有良好的拉絲性，且表面光滑、無臭味及不良異味，酸甜適中，口感平滑細膩。本研究表明：與對照組相比，添加益生菌L.plantarumP8后對發(fā)酵產(chǎn)品外觀、氣味、質(zhì)地等指標有所改善，SAARELA等[28]研究也表明在產(chǎn)品中添加益生菌有助于提高產(chǎn)品感官品質(zhì)，這與本研究結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

本研究對復(fù)合發(fā)酵劑S10+P-8在豆乳發(fā)酵期間及貯藏過程的時間、活菌數(shù)、酸度、黏度、持水性、活性大豆異黃酮轉(zhuǎn)化量、質(zhì)構(gòu)特性、基本味覺特性進行測定，對感官進行品鑒。與2種商業(yè)豆乳發(fā)酵劑相比，發(fā)酵劑S10+P-8具有良好的發(fā)酵特性及貯藏穩(wěn)定性，且具有更好的活性大豆異黃酮轉(zhuǎn)化能力，在貯藏期間能提供較高的益生菌活菌數(shù)，在發(fā)酵豆乳制品開發(fā)中具有良好應(yīng)用潛力。