高危型人乳頭瘤狀病毒感染和p16INK4A在食管鱗癌患者中的預(yù)后價(jià)值

王寧寧 王展梅 曹芳麗 曲琳莉 孟思博 玄甜甜 孫穎

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)化療科，山東 青島 266035；2聊城市人民醫(yī)院腫瘤科)

在發(fā)展中國家，食管癌是非常常見的消化道惡性腫瘤，預(yù)后不佳〔1〕。我國北方地區(qū)是食管癌發(fā)病率最高的地域之一〔2〕，據(jù)2015年最新統(tǒng)計(jì)，食管癌發(fā)病率位居第3，僅次支氣管肺癌、胃癌〔3〕，死亡率次于支氣管肺癌、胃癌、肝癌，居腫瘤相關(guān)死亡的第四位，5年生存率僅10%左右〔4〕。世界上每年超過55萬的新發(fā)惡性腫瘤患者與HPV感染有關(guān)〔5〕。根據(jù)以前的研究報(bào)道，人乳頭瘤病毒(HPV)16是最常見的感染類型，其次常見的是HPV18〔6〕，其他亞型的HPV感染極為罕見〔7〕。1981年Syrj?nen提出了食管癌發(fā)生的誘因之一為HPV感染〔8〕，之后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)HPV感染是食管癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素，但HPV感染在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的致癌機(jī)制不清楚，具有爭(zhēng)議?；仡櫺缘呐R床研究中，HPV陽性的患者比陰性的患者具有較好的預(yù)后〔9～13〕。基于以前的研究，我們?cè)噲D確定食管癌中HPV感染和p16的表達(dá)，我們也試圖評(píng)估p16和HPV感染在進(jìn)行根治術(shù)的食管鱗癌患者中的預(yù)后價(jià)值。我們希望找到一個(gè)更合理的治療方式，我們最大的目標(biāo)是希望可以利用現(xiàn)有的和正在開發(fā)的HPV疫苗，通過大規(guī)模疫苗接種預(yù)防和治療這些HPV相關(guān)的惡性腫瘤。

1 材料與方法

1.1病人和組織標(biāo)本 我們查詢山東大學(xué)齊魯醫(yī)院的病案室有關(guān)食管癌患者的資料，選擇2006年12月至2008年1月行食管癌手術(shù)的273例患者為研究對(duì)象，排除術(shù)前進(jìn)行放化療的患者及術(shù)后30 d內(nèi)死亡的患者，其他的排除標(biāo)準(zhǔn)包括：非鱗狀細(xì)胞的病理類型、不能合作及失訪的患者，所有患者要求18歲以上，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)備案。具有足夠的蠟塊進(jìn)行切片行各項(xiàng)檢測(cè)的共有105例患者符合入組標(biāo)準(zhǔn)，所有患者簽寫書面的知情同意書。105例患者有足夠的蠟塊進(jìn)行切片行各項(xiàng)檢測(cè)，每1例患者經(jīng)HE染色確診為食管鱗癌，術(shù)后臨床分期以2010版AJCC分期為標(biāo)準(zhǔn)〔14〕。2011年全新修訂的中國居民膳食指南中指出，飲酒史以0.025 kg/d為分界線。血紅蛋白分界點(diǎn)為男性120 g/L和女性110 g/L。105例患者中男81例，女24例，中位年齡60(42～78)歲，中位隨訪時(shí)間42.4(4～61)個(gè)月。39例患者檢測(cè)p16陽性。

1.2手術(shù) 食管癌根治術(shù)的類型包括Ivor-Lewis和三切口(右開胸，開腹和左頸部切口)。大多數(shù)患者接受了Ivor-Lewis手術(shù)(n=92)。

1.3隨訪 所有患者隨訪至死亡或滿5年。隨訪時(shí)間為從手術(shù)日期至死亡或最后一次接觸之日。術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查，以后每6個(gè)月復(fù)查病情，項(xiàng)目包括體格檢查、血液及影像檢查，必要時(shí)進(jìn)行食管鏡檢查。常規(guī)的臨床參數(shù)是從住院患者數(shù)據(jù)庫或山東大學(xué)齊魯醫(yī)院門診腫瘤登記處獲得。

1.4實(shí)驗(yàn)室檢查 石蠟切片常規(guī)處理后用生物素標(biāo)記的高危型HPV16或者HPV18標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行檢測(cè)，信號(hào)放大后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)系統(tǒng)顯色，蘇木精復(fù)染。以HPV陽性的子宮頸鱗癌為陽性對(duì)照，其棕染的顆粒位于細(xì)胞核內(nèi)，不采用HPV標(biāo)記探針的結(jié)果為陰性對(duì)照。食管鱗狀細(xì)胞癌胞核內(nèi)染色為棕色定義為HPV感染陽性〔15〕。所有的結(jié)果判定在不知p16結(jié)果的情況下進(jìn)行。免疫組化檢測(cè)p16：應(yīng)用Envision-System法，抗體為鼠抗人p16INK4a單克隆抗體一抗(克隆號(hào)：GK500715,Dako，1∶100)，進(jìn)行信號(hào)放大后DAB系統(tǒng)染色，蘇木精復(fù)染。陽性對(duì)照采用p16陽性表達(dá)的切片，陰性對(duì)照通過不加一抗獲得。HPV感染陽性的食管鱗癌細(xì)胞核呈棕色染色?！?0%的細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞核棕染判定為p16陽性。結(jié)果由不了解本研究的病理科醫(yī)師判定。

1.5研究終點(diǎn) 研究的主要終點(diǎn)是總生存期，定義：從手術(shù)日期至死亡或隨訪的最后日期的時(shí)間。次要終點(diǎn)包括無進(jìn)展生存期，定義為從手術(shù)日期至局部或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的時(shí)間。局部復(fù)發(fā)是指區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或腫瘤局部復(fù)發(fā)。無腫瘤復(fù)發(fā)的死亡或者原因不明的死亡認(rèn)定為局部疾病進(jìn)展相關(guān)的死亡。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。生存曲線采用Kaplan-Meier法制作，生存率差異分析采用Log-rank檢驗(yàn)。HPV陽性/陰性的風(fēng)險(xiǎn)比分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。

2 結(jié) 果

2.1p16與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床及病理因素的相關(guān)性 p16陽性的患者表現(xiàn)為較高的分化程度，更好的體能狀態(tài)，并且吸煙較少(P<0.05)，見表1。

表1 食管鱗癌105例患者p16陽性表達(dá)(n)

1)Kruskal-Wallis

2.2p16蛋白表達(dá)與HPV感染的分析 免疫組化染色顯示p16蛋白在食管鱗癌組織的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)呈棕染表達(dá)；39例患者中86.2%的患者(29例)HPV陽性，原位雜交染色顯示食管鱗癌組織感染的HPV也在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，同樣呈棕染，見圖1。66例p16陰性的患者中僅4例患者(6.1%)檢測(cè)到HPV陽性，Kappa檢驗(yàn)后，Cohen Kappa系數(shù)為0.61，p16與HPV兩者的表達(dá)具有一致性(P<0.001，Kappa = 0.61;95%CI=0.45～0.77)。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌中p16、HPV陽性表達(dá)(×200)

2.3生存分析 根據(jù)Kaplan-Meier檢驗(yàn)結(jié)果，p16陽性組患者較HPV陰性組預(yù)后較好，p16陽性患者的5年生存率為64.1%，HPV陰性患者5年生存率為45.5%(HR=0.49，95%CI=0.26～0.91，P=0.02)。HPV陰性組患者5年無進(jìn)展生存率為37.9%，p16陽性組患者5年無進(jìn)展生存率為58.7%(HR=0.45，95%CI=0.24～0.83,P=0.007)。應(yīng)用HPV作為分層因素進(jìn)行預(yù)后分析的結(jié)果與上述結(jié)果一致。HPV陽性組和陰性組的5年生存率分別是64.1%和45.5%(HR=0.31，95%CI=0.14～0.68;P=0.004)。HPV陽性組和陰性組的5年無進(jìn)展生存率是58.7%和37.9%(HR=0.33，95%CI=0.16～0.68，P= 0.002)。

單因素分析有意義的預(yù)后因素包括血紅蛋白(HR=1.71,95%CI=0.54～6.29,P=0.39)、T分期(HR=1.04,95%CI=0.58～2.12,P=0.69)、N分期(HR=1.79,95%CI=0.85～3.78,P=0.13)、吸煙(HR=0.81,95%CI=0.46～1.51,P=0.43)、ECOG體能狀態(tài)(HR=3.08,95%CI=1.08～9.04,P=0.04)和p16蛋白表達(dá)(HR=4.23,95%CI=1.75～8.54,P=0.03)，經(jīng)總生存率和無疾病進(jìn)展率的Cox回歸分析，對(duì)總生存率有影響意義的因素是p16蛋白表達(dá)和ECOG體能狀態(tài)；經(jīng)血紅蛋白、T分期、N分期、吸煙、ECOG體能狀態(tài)等因素校正后，p16蛋白表達(dá)是影響患者無疾病進(jìn)展率的唯一多變量因素(HR=2.52,95%CI= 1.12～5.71,P=0.02)。p16陽性患者較陰性患者降低了58%的死亡風(fēng)險(xiǎn)(校正后HR=0.42,95%CI=0.26～0.91,P=0.03)，降低了61%的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)(校正后HR=0.39,95%CI=0.27～0.77,P=0.02)。

3 討 論

HPV是一種小的雙鏈脫氧核糖核酸病毒。本研究結(jié)果顯示31.4%的食管鱗癌組織感染HPV，這個(gè)結(jié)果與既往中國其他食管癌高發(fā)區(qū)的研究結(jié)果是一致的〔16,17〕。本研究的患者來自于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東省在中國屬于食管癌的高發(fā)區(qū)〔18〕。

HPV感染鱗狀上皮后p16蛋白會(huì)出現(xiàn)過度表達(dá)已經(jīng)成為大家公認(rèn)的結(jié)果，在HPV相關(guān)的鱗癌組織中p16免疫組化染色早已被認(rèn)定為一個(gè)客觀的HPV感染的生物標(biāo)志物〔19〕。HPV陰性的腫瘤組織中，9p21的滅活降低了p16蛋白的表達(dá)，因此，通過p16蛋白的免疫組化染色來區(qū)分腫瘤組織中HPV的陽性或陰性，HPV陰性的食管鱗癌組織中p16蛋白一般呈低表達(dá)〔20〕，通常認(rèn)為p16蛋白水平升高是E7癌蛋白發(fā)揮功能的結(jié)果，而E7蛋白是HPV感染組織后惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵〔21〕?；仡櫺匝芯糠磸?fù)報(bào)道HPV相關(guān)性腫瘤具有較好的預(yù)后，這些研究主要是頭頸部腫瘤，尤其是口咽部鱗狀細(xì)胞癌〔16～20〕。本研究揭示了p16和HPV感染在食管鱗癌中的預(yù)后價(jià)值，p16陽性的患者具有較好的預(yù)后。應(yīng)用HPV作為分層因素，預(yù)后結(jié)果與上述結(jié)果大致相同。

本研究通過免疫組化檢測(cè)p16和原位雜交法檢測(cè)HPV，認(rèn)為免疫組化p16可作為一種有效的HPV檢測(cè)替代辦法。免疫組化技術(shù)操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，成本低，適合于廣泛地臨床推廣和使用〔12〕。

本研究清楚地表明，p16陽性表達(dá)的患者具有較高的腫瘤的分化程度和較好的體能評(píng)分，并且p16陽性的患者吸煙的概更低。這3個(gè)方面之間顯著差異可能是解釋p16陽性患者較好的原因。另外1個(gè)假說也可以解釋這種現(xiàn)象，HPV結(jié)合到DNA中，表達(dá)癌蛋白：E6和E7，消弱了p53和Rb蛋白的功能，促進(jìn)了基因重組〔22〕，重組的DNA理論上對(duì)放療和化療更加敏感〔23〕，為HPV陽性患者具有較好預(yù)后提供了一個(gè)假說。本研究樣本小，無法排除混雜由HPV感染和治療模式帶來的混淆結(jié)果，所以不能一定得出確切的定論，需要更大的、多層的分析研究來解釋說明這種結(jié)果。

HPV感染和吸煙之間的聯(lián)系仍在研究中，有研究表明二者之間具有協(xié)同作用〔24〕，煙草誘發(fā)的相關(guān)的致癌基因的變異可能因?yàn)镠PV感染，進(jìn)一步重排，加劇DNA突變，基因組的不穩(wěn)定性造成細(xì)胞周期紊亂，這可以解釋為什么P16陽性患者不太可能是吸煙者，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究表明，在食管癌中p16蛋白表達(dá)與分化程度有關(guān)，可以作為腫瘤分化程度的一個(gè)參考指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)較高的ECOG評(píng)分與p16陽性率有關(guān)，ECOG評(píng)分低的患者p16蛋白陽性率較低。以前的研究也報(bào)道過ECOG體能狀態(tài)與p16蛋白的關(guān)系，但二者之間的關(guān)聯(lián)目前沒有明確的解釋，可能與這些研究的樣本量小有關(guān)〔25〕。

本研究明確表明經(jīng)根治術(shù)后HPV相關(guān)性或者p16陽性的食管癌患者具有較好的預(yù)后，而且HPV感染或p16蛋白是獨(dú)立的預(yù)后影響因子。但由于本研究是小樣本回顧性研究，而且隨訪中出現(xiàn)了部分失訪，還需進(jìn)行較大樣本量的前瞻性研究證實(shí)p16蛋白表達(dá)與HPV感染兩者之間的一致性及p16蛋白在分子生物學(xué)水平上作為預(yù)后因素的可行性。