屏邊三七種子后熟生理研究Ⅱ. 層積后的種子內(nèi)源抑制物粗提取及生物活性測定

孫玉琴，楊 莉，陳中堅(jiān)，王朝梁，韋美麗，黃天衛(wèi)，施莉屏

(文山學(xué)院文山三七研究院，云南 文山 663000)

【研究意義】屏邊三七(PanaxstipuleanatusH.T.Tsai et K.M.Feng)是五加科人參屬植物，又名野三七、竹節(jié)七等，其根具有散瘀定通、療傷止血、滋補(bǔ)等功效，僅分布于云南東南部(屏邊、馬關(guān)、麻栗坡)及越南北方(老街)的低海拔(1100～1700 m)山谷潮濕林內(nèi)[1]，貴州水城也有分布，目前屏邊三七在野外采集已經(jīng)比較困難，資源處于嚴(yán)重缺乏的處境，因此被國家列為二級保護(hù)植物[2]。通過長期對屏邊三七的人工栽培中觀察到，它的栽培環(huán)境與五加科人參屬植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]類似，并且，作為三七的近緣物種屏邊三七在其相同的生長環(huán)境下抗病性狀表現(xiàn)優(yōu)異，與三七在同一蔭棚內(nèi)種植的屏邊三七極少感病，對三七的地上部分病害表現(xiàn)免疫[3]。在人參屬的所有物種中，由于三七沒有姊妹種，屏邊三七和三七具有次最近的共同祖先，是三七的一種重要近緣種[4]，目前對三七的抗病品種選育起了不可替代的作用，同時(shí)對西南地區(qū)人參屬植物種質(zhì)資源圃的建立有重要意義。【前人研究進(jìn)展】種子是種子植物特有的繁殖體，對于植物也是種質(zhì)資源保存的重要材料。和其他人參屬植物一樣，屏邊三七也具有種子后熟的特性。種子休眠，是植物體延遲萌發(fā)時(shí)間，以免外界不良環(huán)境對植物體造成危害，而慢慢形成的特性[5]，許多研究表明，植物種子中存在萌發(fā)抑制物質(zhì)是導(dǎo)致種子休眠的一個(gè)主要因素[6], 種子中的很大一部分發(fā)芽抑制物質(zhì)是一些簡單的小分子有機(jī)物質(zhì)，其中有一部分是水溶性的[7]。能從果皮、種皮、種胚中提取出萌發(fā)抑制物，是酸性或中性等物質(zhì)[8]。在種子休眠的過程中，內(nèi)源抑制物的種類是在不斷變化的[9]。至今對屏邊三七的研究主要針對化學(xué)成分[10]、分類[11]、地理分布[12-13]、生物學(xué)特性[14-15]、光和日變化[16]，分子生物學(xué)[17-20]、葉型[21]等方面?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】針對屏邊三七種子發(fā)芽抑制物的研究，前期做了鮮種內(nèi)源抑制物質(zhì)的粗提取及生物活性測定[22]，發(fā)現(xiàn)屏邊三七種子中確有發(fā)芽抑制物質(zhì)存在，種子中各部位的抑制物活性依次為果肉>胚乳>種皮。但屏邊三七種子層積后，內(nèi)源抑制物變化情況未見報(bào)道，為此對層積不同天數(shù)的屏邊三七種子進(jìn)行內(nèi)源抑制物的粗提取及生物活性測定，旨在為屏邊三七種子休眠機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，也是三七與屏邊三七的雜交育種的重要前期工作?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本實(shí)驗(yàn)通過對層積不同天數(shù)的屏邊三七種子的內(nèi)源抑制物粗提取及生物活性測定，了解內(nèi)源抑制物質(zhì)在屏邊三七種子后熟期間的變化趨勢，以及對種子休眠的影響程度，為今后打破屏邊三七種子休眠特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來源于文山三七研究院硯山試驗(yàn)場種質(zhì)資源圃中的多年生屏邊三七種子，于2015年7月采集，采集后用濕沙層積備用。

1.2 內(nèi)源抑制物的粗提取方法

層積后每35 d，采集含100粒種子，分離種皮、胚乳(含胚)，分別稱重、磨碎后，裝入3個(gè)50 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇，室溫下浸提72 h。用濾紙分離濾液和殘?jiān)?殘?jiān)糜? ℃冰箱保存)，濾液用60 ℃水浴揮干甲醇，所得濃縮液加入25 mL石油醚萃取后，分離水相和石油醚相。所得水相加入乙醚萃取，分離水相及乙醚相。所得水相繼續(xù)用乙酸乙酯萃取，分離水相及乙酸乙酯相。水相利用60 ℃水浴蒸干，除去水，所得干物質(zhì)加入25 mL甲醇后，用濾紙分離殘?jiān)凹状枷唷堅(jiān)屑尤胨?，得水相?/p>

1.3 抑制物的生物活性測定

(1)受體材料：選取白菜種子作為受體材料。為云南省昆明市春農(nóng)種業(yè)商貿(mào)有限公司的日本金黃58品種。

(2)各取3 mL內(nèi)源抑制物5種相(石油醚相，乙醚相，乙酸乙酯相，甲醇相及水相)，揮干有機(jī)溶劑后加入蒸餾水3 mL，水相直接取3 mL進(jìn)行抑制活性測定，重復(fù)3次，以蒸餾水為對照。

(3)將從上述各處理中獲得的組份，放入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，皿中放一直徑7 cm的濾紙，揮干有機(jī)溶劑后加入蒸餾水3 mL (水相則直接量取3 mL，不必再加蒸餾水)，每皿放白菜30粒，重復(fù)3次，培養(yǎng)皿應(yīng)傾斜放置，利用地心引力使胚根平直生長，易于測量。在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h觀察發(fā)芽率，48 h測量胚根長度。

1.4 供試有機(jī)溶劑的抑制作用檢測

取石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇各3 mL，放入培養(yǎng)皿內(nèi)揮干后加3 mL 蒸餾水進(jìn)行白菜發(fā)芽試驗(yàn)以確定其抑制活性。重復(fù)3次，以這4種有機(jī)溶劑作為陽性對照，以蒸餾水做為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 屏邊三七種子層積處理不同天數(shù)對白菜種子發(fā)芽的影響

屏邊三七種子采收后常規(guī)處理要用濕沙儲藏，以完成種子后熟。一般儲藏時(shí)間為5～6 個(gè)月，因此，設(shè)置屏邊三七層積處理的時(shí)間為175 d，每35 d取出100粒種子用系統(tǒng)溶劑提取法，分別提取分離的種皮和種胚，用提取液對白菜種子做生物活性測定，白菜種子發(fā)芽率結(jié)果見表1，陽性對照石油醚組白菜種子發(fā)芽率為70.44 %，乙醚組白菜種子發(fā)芽率為83.18 %，乙酸乙酯組白菜種子發(fā)芽率為75.61 %，甲醇組白菜種子發(fā)芽率為72.44 %，陰性對照蒸餾水組白菜種子發(fā)芽率為86.67 %。

白菜種子發(fā)芽率試驗(yàn)結(jié)果表明，屏邊三七種子層積35 d后，種皮、種胚提取相對白菜種子發(fā)芽抑制強(qiáng)度最大，發(fā)芽率最低，隨著種子層積時(shí)間的增加，發(fā)芽率逐漸升高，層積175 d后種子發(fā)芽率最高，層積后種皮、種胚各提取相的白菜種子發(fā)芽率依次為層積175 d>層積140 d>層積105 d>層積70 d>層積35 d。

隨著層積時(shí)間的增加，白菜種子的發(fā)芽率逐漸增高，說明各提取液對白菜種子的發(fā)芽抑制作用隨層積時(shí)間的增加，抑制作用逐步減弱。種子各部位生物活性測定結(jié)果顯示，各提取相對白菜種子發(fā)芽抑制作用種胚的要大于種皮的，說明發(fā)芽抑制物質(zhì)主要存在于種胚中。屏邊三七種子在層積105 d后，種皮、種胚提取相的發(fā)芽抑制物質(zhì)對白菜種子發(fā)芽的影響逐漸減弱，發(fā)芽率與陽性對照組差別不明顯；種子層積到175 d時(shí)，發(fā)芽抑制作用基本解除，發(fā)芽率與陰性對照差別不明顯。

2.2 屏邊三七種子層積處理不同天數(shù)對白菜種子生長的影響

2.2.1 層積試驗(yàn)中白菜種子生物活性測定結(jié)果屏邊三七種子層積不同天數(shù)生物活性測定結(jié)果見表2，所用不同溶劑及蒸餾水對白菜種子生長影響的陰性對照和陽性對照結(jié)果見表3。

表1 層積不同天數(shù)的屏邊三七種子的內(nèi)源抑制物提取液對白菜種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effect of extract of PSS with different stratification duration on the rate of cabbage seed germination (n=90粒)

2.2.2 層積不同天數(shù)后，屏邊三七種子各部位不同提取相對白菜胚根、胚芽生長比較 屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種皮中內(nèi)源抑制物，測定白菜胚根生長情況，由表4可見，隨著屏邊三七種子層積時(shí)間的增加，白菜胚根長度逐漸增加。SPSS軟件分析顯示，層積140和175 d的胚根長度與層積35、70、105 d的胚根長度之間達(dá)顯著性差異；層積140和175 d 兩者及層積35、70和105 d三者之間的差異均不大。同一種有機(jī)溶劑提取液提取層積不同天數(shù)處理的屏邊三七種皮，對白菜種子胚根生長的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

表2 屏邊三七種子層積不同天數(shù)對白菜胚根、胚芽生長的影響Table 2 Effect of extract of PSS with different stratification duration on development of radicle and germ of cabbage seed

表3 不同溶劑對白菜胚根、胚芽生長的影響Table 3 Effect of extracts with different solvents on development of cabbage seed

表4 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種皮不同提取相對白菜胚根生長的影響Table 4 Effect of P. stipulenatus seed coat extract with different stratification duration on radicle development of cabbage seed

注：采用LSD法進(jìn)行顯著性分析，同一行不同小寫字母為5 %差異顯著，下同。
Notes：LSD methods was used to analyze the significance, the different letters in the same line meant 5 % significant difference, the same as below.

表5 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種胚不同提取相對白菜胚根生長的影響Table 5 Effect of PSS embryo extract with different stratification duration on radicle development of cabbage seed

屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種胚中內(nèi)源抑制物，測定白菜胚根生長情況，由表5可見，隨著屏邊種子層積時(shí)間的增加，白菜胚根長度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。SPSS軟件分析顯示，除乙醚提取相外，層積140 d的胚根長度與層積175 d 的胚根長度達(dá)顯著性差異；層積140和175 d的胚根長度與層積35、70、105 d的胚根長度之間達(dá)顯著差異；同一種有機(jī)溶劑提取液提取屏邊三七種胚，除140和175 d乙醚提取相外，層積不同天數(shù)的處理間都表現(xiàn)出顯著性差異。層積不同天數(shù)的屏邊三七種胚，使用同一種有機(jī)溶劑提取液提取的發(fā)芽抑制物對白菜種子胚根生長的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種皮中內(nèi)源抑制物，測定白菜胚芽生長情況，由表6可見，隨著屏邊三七種子層積時(shí)間的增加，白菜胚芽長度逐漸增加，SPSS軟件分析結(jié)果表明，層積140和175 d的胚根長度與層積35 d的胚根長度之間達(dá)顯著性差異；種皮水相對白菜胚芽生長測定結(jié)果顯示，層積不同天數(shù)的處理間都表現(xiàn)出顯著性差異，其它4種有機(jī)溶劑提取相對白菜胚芽生長測定結(jié)果顯示，層積不同天數(shù)的處理間不完全表現(xiàn)出顯著性差異。層積不同天數(shù)的屏邊三七種皮，使用同一種有機(jī)溶劑提取液提取的發(fā)芽抑制物對白菜種子胚芽生長的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

表6 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種皮不同提取相對白菜胚芽生長的影響Table 6 Effect of PSS coat extract with different stratification duration on germ development of cabbage seed

表7 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種胚不同提取相對白菜胚芽生長的影響Table 7 Effect of PSS embryo extract with different stratification duration on germ development of cabbage seed

屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種胚中內(nèi)源抑制物，測定白菜胚芽生長情況，由表7可見，隨著屏邊三七種子層積時(shí)間的增加，白菜胚芽長度逐漸增加，SPSS軟件分析顯示，層積175 d的胚芽長度與層積35、70、105 d的胚芽長度之間以及層積140 d的胚芽長度與層積35 d的胚芽長度之間均達(dá)顯著差異；測定種胚乙醚相和種胚水相對白菜胚芽生長，層積不同天數(shù)的處理間都表現(xiàn)出顯著性差異，其它3種有機(jī)溶劑提取相對白菜胚芽生長，層積不同天數(shù)的處理間不完全表現(xiàn)出顯著性差異。層積不同天數(shù)的屏邊三七種胚，使用同一種有機(jī)溶劑提取液提取的發(fā)芽抑制物對白菜種子胚芽生長的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

3 討 論

(1)屏邊三七種子層積175 d后，發(fā)芽抑制作用基本解除，這與陳中堅(jiān)對于屏邊三七種子休眠研究中——屏邊三七種子的休眠期長達(dá)165～180 d，在種子離開母體后，種胚還在不斷生長，直至成熟[2]的結(jié)論一致。層積后屏邊三七種子內(nèi)源抑制物質(zhì)不斷減弱，層積不同天數(shù)后屏邊三七種子中內(nèi)源抑制物對白菜種子發(fā)芽及生長的抑制作用逐漸下降，與此同時(shí)，屏邊三七種子的胚芽也在生長過程中，抑制物質(zhì)主要集中在種胚中，可以提示屏邊三七種子形態(tài)后熟的原因與內(nèi)源抑制物相關(guān)，內(nèi)源抑制物種類隨著層積時(shí)間是否會發(fā)生變化，有待進(jìn)一步研究。

(2)對新鮮屏邊三七種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的粗提取及生物活性測定結(jié)果表明，屏邊三七種子中所含的內(nèi)源抑制物主要集中在果肉及胚乳中(另文報(bào)道)，種子經(jīng)過層積后，果肉已經(jīng)不存在，種胚(含胚乳)內(nèi)源抑制物質(zhì)活性要明顯高于種皮，說明胚乳中抑制物質(zhì)的存在，可能是胚形態(tài)較小、胚率值極小、種子休眠的主要原因。關(guān)于種子不同部位所含抑制物質(zhì)在活性上的差異，是因?yàn)樗种莆镔|(zhì)多少不同，還是因?yàn)樗种莆镔|(zhì)種類或性質(zhì)不同，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

層積試驗(yàn)對白菜種子的生物活性測定結(jié)果表明，隨著種子層積時(shí)間的增加，白菜種子的發(fā)芽率逐漸增高，且胚根、胚芽的長度均有所增長，說明屏邊三七種子隨著層積時(shí)間的增加，種子中的內(nèi)源抑制物質(zhì)在減少，抑制白菜種子發(fā)芽的作用減弱；屏邊三七種子各提取相對白菜種子萌發(fā)的生物活性測定中，種皮各提取相測定白菜種子胚根、胚芽的長度均大于種胚各提取相測定的白菜種子胚根、胚芽的長度，說明種胚各提取相對白菜種子生長的抑制作用大于種皮各提取相，這也表明層積過程中屏邊三七種子的發(fā)芽抑制物主要集中在種胚中；屏邊三七種子層積到175 d時(shí)，發(fā)芽抑制作用基本解除，此時(shí)屏邊三七種子后熟過程已經(jīng)完成，休眠已經(jīng)完全被打破。