外周調(diào)節(jié)性細(xì)胞在接受非小細(xì)胞肺癌放療患者中的運(yùn)用

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在中國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡原因中占首位。研究數(shù)據(jù)顯示，肺癌中80%患者屬于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），75%患者在確診時(shí)已處于中晚期，NSCLC患者的5年生存率極低［1-2］。肺癌包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞肺癌等幾種常見的類型，與小細(xì)胞肺癌相比NSCLC癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較慢、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移均較晚［3］。放射治療（radiotherapy，RT）已成為NSCLC的主要治療手段，尤其是早期治療除了直接殺傷作用外，輻射還可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而消除未受輻射的腫瘤細(xì)胞［4］。根據(jù)RT的免疫機(jī)制，提示放療前的免疫狀態(tài)可能影響腫瘤對(duì)輻射的反應(yīng)，從而影響腫瘤的長(zhǎng)期生存［5］。腫瘤免疫編輯理論，包括免疫消除、平衡和逃避，描述了免疫在腫瘤抑制和保護(hù)中的雙重作用［6］。癌癥患者的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。淋巴細(xì)胞為人體細(xì)胞免疫的重要組成部分，根據(jù)不同的表型和功能，可觀察到不同的淋巴細(xì)胞亞群。已有多項(xiàng)研究對(duì)NSCLC患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)進(jìn)行探討［7］。如肺癌患者CD4+細(xì)胞（T輔助細(xì)胞）、CD4/CD8比值和B細(xì)胞比例下降，CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平升高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）增多。除了淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)外，研究人員還測(cè)試了其在NSCLC中的預(yù)測(cè)和預(yù)后作用，多項(xiàng)研究證實(shí)了CD3+、CD4+、CD8+、Treg細(xì)胞等不同亞型腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值［8］。然而，淋巴細(xì)胞亞群在外周血中的預(yù)測(cè)作用尚無充分的研究。因此，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的含量，并分析其對(duì)接受放療的NSCLC無進(jìn)展生存期患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選擇2016年1月至2017年12月九江市第三人民醫(yī)院105例NSCLC患者及同期體檢的45例健康受試者進(jìn)行研究，其中62例為初診患者，43例為復(fù)發(fā)患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）NSCLC患者符合《2014版NCCN臨床實(shí)踐指南》［8］中的相關(guān)診斷；2）初診患者在就診前未接受過抗癌治療，復(fù)發(fā)患者在就診前3個(gè)月內(nèi)未接受過腫瘤治療、免疫治療及類固醇治療；3）患者神智清晰可與醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行正常交流；4）患者已獲知情同意并簽署相關(guān)文件。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并其他惡性腫瘤的患者；2）合并自身免疫疾病的患者。

1.2 方法

1.2.1 治療和隨訪 初診62例NSCLC患者分別接受RT或聯(lián)合靶向治療，同時(shí)或連續(xù)行RT。23EX直線加速器（購(gòu)自美國(guó)瓦里安醫(yī)療系統(tǒng)公司）30～50 Gy/5級(jí)，常規(guī)放射治療為60～66 Gy/30～33次，采用直線加速器。根據(jù)患者病情采用克唑替尼、厄洛替尼和吉非替尼進(jìn)行靶向治療。放療后每3個(gè)月定期隨訪1次，隨訪2017年12月20日結(jié)束。中位隨訪時(shí)間為12.5（5～22）個(gè)月，以無進(jìn)展生存為主要終點(diǎn)。

1.2.2 采集 患者在抗癌治療之前和志愿者身上采集的空腹外周靜脈血5 mL。用10種特異性單克隆抗體（mAbs），包括：抗CD3（APC和PerCP）、CD4（FITC和 APC）、CD8（FITC 和 APC）、CD16（PE）、CD19（APC）、CD25（APC）、CD28（PE）、CD56（PE）、CD127（PE）和TCR（PE）的特異性單克隆抗體對(duì)淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分化。開始時(shí)，將100 μL新鮮血液與上述mAb混合，在室溫下在黑暗中孵育15 min。使用FACS裂解液（購(gòu)自美國(guó)BD生物科學(xué)公司）在混合中溶解紅細(xì)胞，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次。然后，用流式細(xì)胞儀分析殘余白細(xì)胞，應(yīng)用Flowjo Version 10數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算淋巴細(xì)胞亞群的比例及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。

1.2.3 放療療效評(píng)估 標(biāo)準(zhǔn)參照實(shí)體腫瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST 1.1）》［9］，分為完全緩解：目標(biāo)病灶消失，病理性淋巴結(jié)短軸值在10 mm以下；部分緩解：以臨界半徑總和為參照物，病灶半徑總和縮小30%以上；疾病進(jìn)展：目標(biāo)病灶半徑總和增加20%以上且絕對(duì)值在5 mm以上；疾病穩(wěn)定：目標(biāo)半徑總和最小值為參照，未達(dá)到緩解標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)也未達(dá)到惡化標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，并以ROC分析外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的預(yù)測(cè)價(jià)值。均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初診NSCLC患者與復(fù)發(fā)NSCLC患者基線特征分析

初診NSCLC患者與復(fù)發(fā)NSCLC患者性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)特征、分化程度、基因突變、T分期、N分期、轉(zhuǎn)移等基線特征差異均無顯著性差異（P＞0.05，表1）。

2.2 NSCLC患者與健康人群淋巴細(xì)胞亞群比例對(duì)比

與健康對(duì)照組相比，NSCLC患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例顯著升高（P＜0.05）；NSCLC患者復(fù)發(fā)時(shí)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)高表達(dá)與初診患者相比得到進(jìn)一步驗(yàn)證，CD19+B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4/CD8比值顯著下降，NSCLC患者CD8+T細(xì)胞和CD8+CD28-T細(xì)胞明顯增加（P＜0.05），而NK、NKT、γδT、CD3+、CD8+CD28+T細(xì)胞在患者與對(duì)照組之間無顯著性差異（P＞0.05）。40例復(fù)發(fā)患者中，轉(zhuǎn)移患者與復(fù)發(fā)患者相比，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多；CD4+T細(xì)胞比例、CD4/CD8比值下降。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2，3）。

2.3 無進(jìn)展生存期患者的單因素分析

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例高與無進(jìn)展生存期相關(guān)（HR=2.55，95%CI：1.07～6.11，P=0.019）。其他淋巴細(xì)胞亞群與無進(jìn)展生存期之間無顯著性關(guān)聯(lián)。除淋巴細(xì)胞亞群外，其中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率與無進(jìn)展生存期呈負(fù)相關(guān)（HR=2.66，95%CI：1.01～7.05，P=0.033）淋巴細(xì)胞與無進(jìn)展生存期呈正相關(guān)（HR=0.42，95%CI：0.17～-1.03，P=0.042）根據(jù)臨床病理特點(diǎn)，NSCLC患者的腫瘤分化程度、T分期、N分期與臨床預(yù)后相關(guān)（HR=4.87，95%CI：1.65～14.30，P=0.018；HR=3.40，95%CI：1.11～12.49，P=0.020，表4）。

2.4 無進(jìn)展生存期患者的多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，無進(jìn)展生存的獨(dú)立性影響因素為CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及N分期（P≤0.010，0.004，0.05，表5）。

表1 兩組患者基線特征對(duì)比

表2 NSCLC患者與健康人群淋巴細(xì)胞亞群比例對(duì)比

表3 局部復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移NSCLS患者淋巴細(xì)胞亞群差異分析

表4 無進(jìn)展生存期患者的單因素分析

表4 無進(jìn)展生存期患者的單因素分析（續(xù)表4）

表5 無進(jìn)展生存期患者的多因素分析

2.5 放療后不同療效患者外周T細(xì)胞表達(dá)情況對(duì)比

疾病進(jìn)展期患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)比例明顯高于疾病穩(wěn)定、部分緩解及完全緩解的患者（χ2=18.417，P＜0.000 1，P＜0.05，表6）。

2.6 ROC分析

通過受試者工作特征曲線（ROC）對(duì)外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)測(cè)NSCLC患者無進(jìn)展生存的診斷效能進(jìn)行分析，AUC為0.915，當(dāng)最佳閾值取2.85時(shí)，外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)測(cè)NSCLC患者無進(jìn)展生存的預(yù)測(cè)敏感度為87.7%，特異性為71.4%，見圖1。

表6 放療后不同療效患者外周T細(xì)胞表達(dá)情況對(duì)比

圖1 ROC分析

3 討論

免疫監(jiān)視是機(jī)體在生理狀態(tài)下免疫系統(tǒng)可及時(shí)發(fā)現(xiàn)突變細(xì)胞及早期腫瘤細(xì)胞而防止腫瘤發(fā)生的功能，同時(shí)腫瘤負(fù)荷使宿主的免疫系統(tǒng)功能失衡，因此可反映腫瘤發(fā)生及發(fā)展［10］。近年來，NSCLC患者的免疫狀態(tài)、病理狀態(tài)和預(yù)后關(guān)系已成為臨床研究的重點(diǎn)［9-10］。近年來，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答起到重要作用，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮抑制效應(yīng)［11-12］。本研究結(jié)果顯示在接受放療的NSCLC患者中，外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的升高與無進(jìn)展生存的改善存在獨(dú)立聯(lián)系。此外，單因素分析中，NLR和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與NSCLC的進(jìn)展有關(guān)。此外，本研究進(jìn)一步證實(shí)NSCLC患者初發(fā)時(shí)外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD8+CD28-T細(xì)胞比例增加，CD4+T細(xì)胞和CD4/CD8比值降低。

多項(xiàng)研究證實(shí)，外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肺癌手術(shù)和化療中的預(yù)后和預(yù)測(cè)意義［13］。在本研究中，證實(shí)了其在NSCLC放療中的預(yù)測(cè)作用。疾病進(jìn)展期患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)比例明顯高于疾病穩(wěn)定、部分緩解及完全緩解的患者（P＜0.05）。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高提示放療后腫瘤進(jìn)展迅速，可能是由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用及其對(duì)輻射的抵抗力所致［14］。除淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞外，本研究還觀察到淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率與無進(jìn)展生存期相關(guān)，這與已發(fā)表的研究一致。通過ROC對(duì)外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)測(cè)NSCLC患者無進(jìn)展生存期的診斷效能進(jìn)行分析，AUC為0.915，當(dāng)最佳閾值取2.85時(shí)，外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)測(cè)NSCLC患者無進(jìn)展生期存的預(yù)測(cè)敏感度為87.7%，特異性為71.4%。作為免疫抑制細(xì)胞，在各種腫瘤和轉(zhuǎn)移性疾病，包括NSCLC患者中，可觀察到CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多［15］。本研究結(jié)果與上述觀察結(jié)果相一致，并支持在初診患者與復(fù)發(fā)患者結(jié)果相一致。此外還發(fā)現(xiàn)，與局部復(fù)發(fā)相比，NSCLC轉(zhuǎn)移性患者的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平較高，提示該細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增加與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)其他淋巴細(xì)胞亞群在轉(zhuǎn)移性疾病和局部復(fù)發(fā)之間無顯著性差異，可能是由于樣本量有限。本研究顯示，NSCLC患者CD4+T細(xì)胞、CD4/CD8比值及CD19+B細(xì)胞比例下降，與以往研究結(jié)果一致［16］，其中CD4+T細(xì)胞是限制自身免疫反應(yīng)的重要因素，可通過不同途徑抑制自體或異體反應(yīng)性T細(xì)胞的活化及增殖，而外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤效應(yīng)性T細(xì)胞有明顯的抑制作用，在抗腫瘤免疫中起到介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的作用［17］。NSCLC患者CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞作為預(yù)防腫瘤進(jìn)展的重要免疫細(xì)胞，其表達(dá)雖未達(dá)到顯著水平，但仍低于正常人。研究顯示，CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可限制CD8+CD28-T細(xì)胞在NSCLC患者中表現(xiàn)出免疫抑制作用，這可能與CD8+T細(xì)胞的增加有關(guān)［18］。此外，NSCLC患者初發(fā)與初診時(shí)相比，上述免疫細(xì)胞的表達(dá)出現(xiàn)異常均得到證實(shí)，可能提示了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在NSCLC患者中的重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示外周CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平可作為NSCLC的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但存在局限性：1）樣本量較??；2）患者臨床分期不一致；3）使用不同的輻射劑量和組分，亟需開展進(jìn)一步研究。