水解膠原蛋白分子量控制技術(shù)的研究

石金扣

摘 要：在鉻革屑中具有較多的膠原蛋白，因此通過合理的手段在鉻革屑中進(jìn)行膠原蛋白的提取，并進(jìn)行有效的利用，是合理應(yīng)用制革廢屑的有效途徑之一。當(dāng)前階段可通過在鉻革屑中進(jìn)行膠原蛋白的提取，制作成醫(yī)用膠原蛋白。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白；實(shí)驗(yàn)儀器；分子量控制

1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)

在自然界中最為豐富的一種蛋白質(zhì)便是膠原蛋白，是一種呈白色的纖維性質(zhì)的生物高分子物質(zhì)。動(dòng)物機(jī)體的各個(gè)組織中均含有膠原蛋白，如動(dòng)物皮膚、骨骼和韌帶等部位，具有一定的結(jié)構(gòu)型和力學(xué)性質(zhì)，因此在動(dòng)物生命活動(dòng)中，膠原帶白發(fā)揮了自身的重要作用。當(dāng)前階段經(jīng)過相關(guān)的研究已發(fā)現(xiàn)十九種以上的膠原蛋白，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的膠原蛋白時(shí)最為常見的膠原帶白類型，生皮中的膠原蛋白則主要為Ⅰ、Ⅲ型。其中在生皮中含量最豐富的便是Ⅰ型膠原蛋白，在其基本結(jié)構(gòu)中的三股螺旋結(jié)構(gòu)主要是由三條α多肽鏈構(gòu)成的，且每條α肽鏈均為左手的螺旋構(gòu)型。三條具有一定獨(dú)立性的左手螺旋肽鏈通過互相纏繞的方式形成右手螺旋的結(jié)構(gòu)，也就是膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)。該螺旋結(jié)構(gòu)具有一定的特殊性，并和二硫鍵、氫鍵等相互作用，從而使膠原帶白所具有的機(jī)械強(qiáng)度得到了一定的保障。

2 水解膠原蛋白分子量控制的研究

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

（1）實(shí)驗(yàn)儀器。本次實(shí)驗(yàn)選擇的是北京華陽利民有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為CL1030的毛細(xì)管電泳儀，美國安捷倫公司生產(chǎn)的液相色譜儀、江蘇榮華儀器制造有效公司生產(chǎn)的水浴恒溫振蕩器、上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的數(shù)顯PH計(jì)、北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的分光光度計(jì)、昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的超聲波清洗機(jī)、上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司生產(chǎn)的恒溫浴鍋、北京雅士林試驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱以及日本生產(chǎn)的電子分析天平。

（2）實(shí)驗(yàn)材料。本次實(shí)驗(yàn)所使用的主要材料為河北東明實(shí)業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)的鉻鞣鉻屑。所使用的實(shí)驗(yàn)試劑有北京化工廠生產(chǎn)的氫氧化鈉、氧化鎂、氫氧化鈣、濃度為98%的硫酸、以及鹽酸，北京化工試劑有限公司生產(chǎn)的氧化鈣，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)的四硼酸鈉，以上作為分析純。北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，以及西隴化工股份有限公司生產(chǎn)的低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和超低分子量的蛋白質(zhì)共同作為生化試劑。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）鉻革屑的理化性質(zhì)。首先測(cè)定其中的灰分，烘干膠原蛋白溶液，并對(duì)其總固體的重量進(jìn)行測(cè)定，通過電爐進(jìn)行碳化，之后通過馬弗爐進(jìn)行灰化。對(duì)灰化后的重量進(jìn)行測(cè)量，其在總固體重量中所占的百分比，即為灰分的含量。之后測(cè)定鉻的含量，將試樣進(jìn)行灰化，之后在熔融的狀態(tài)下，即溫度為400攝氏度的條件下，通過氯酸鉀實(shí)現(xiàn)三價(jià)鉻到六價(jià)鉻的氧化。在高溫條件下會(huì)將過多余的氯酸鉀分家，之后通過分光光度法進(jìn)行六價(jià)鉻含量的測(cè)定。然后測(cè)定其中的水分，此時(shí)應(yīng)按照國家相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)法烘箱法進(jìn)行。最后測(cè)量其PH值，可對(duì)革試樣的浸出液的PH值進(jìn)行測(cè)定，將其作為革的PH值。

（2）膠原蛋白的提取?？赏ㄟ^以下幾種方法對(duì)其中的較膠原蛋白進(jìn)行提?。浩湟槐闶峭ㄟ^堿法水解對(duì)膠原蛋白進(jìn)行提取，取10克左右的革屑粉碎后加入濃度為6%的堿劑，并在85攝氏度的環(huán)境下進(jìn)行5個(gè)小時(shí)的水解。冷卻水解后的溶液并進(jìn)行過濾，獲取具有一定粘稠性的水解膠原液，將其烘干獲得膠原蛋白粉末。其二便是通過堿酶法水解對(duì)膠原蛋白進(jìn)行提取，取10克左右的革屑粉碎后加入濃度為4%的堿劑，之后在80攝氏度的環(huán)境下，在水浴恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的水解。水解后將溫度降到適合酶的溫度，然后將堿劑、硫酸加入進(jìn)去，將PH至調(diào)節(jié)到適合酶的PH值。將0.05克的酶加入進(jìn)去，并進(jìn)行1個(gè)小時(shí)的反應(yīng)。水解溶液冷卻后進(jìn)行過濾，獲取具有粘稠性的水解膠原液，將其烘干獲得膠原蛋白粉末。其三便是通過酸法進(jìn)行膠原蛋白的提取，取出10克的革屑粉碎后向其加入約為0.3毫升的硫酸或0.8毫升的草酸，在80攝氏度的環(huán)境下，在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行2個(gè)小時(shí)的水解。完成反應(yīng)后將氧化鈣加入，從而對(duì)反應(yīng)液的PH值進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過高溫進(jìn)行加入直至藍(lán)色溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色溶液，并出現(xiàn)淺藍(lán)色的沉淀。水解液冷卻后進(jìn)行過濾，將獲取的具有粘稠性的水解膠原液進(jìn)行烘干，從而獲得膠原蛋白粉末。其四便是通過酸酶水解法進(jìn)行膠原蛋白的提取，向粉碎的10g革屑中加入0.2ml的硫酸（或0.7g的草酸），80°C下在水浴恒溫振蕩器中水解2h，將溫度降至酶的最適溫度，加入NaOH或相應(yīng)的酸（硫酸（98%）、草酸）調(diào)反應(yīng)液的pH至酶的最適pH，加入0.1g的酸性蛋白酶反應(yīng)1h。反應(yīng)完之后，加入Ca（OH）2調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值在10左右，高溫加熱，直到藍(lán)色的溶液變?yōu)榈S色，并且有淺藍(lán)色沉淀為止。將水解液冷卻過濾，得到粘稠的水解膠原液，烘干，得到膠原蛋白粉末。還需要對(duì)提取率進(jìn)行測(cè)定，提取率表明革屑的水解程度。水解反應(yīng)前鉻革屑質(zhì)量記為mj，水分質(zhì)量記為m2，灰分質(zhì)量記為m3。水解反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將水解液烘干，稱重，即膠原蛋白的質(zhì)量記為m4（灰分含量很少，可以忽略不計(jì)），按下面公式計(jì)算提取率。

提取率=■×100%

3 毛細(xì)管電泳技術(shù)測(cè)定膠原蛋白樣品的分子量

3.1 新毛細(xì)管的處理方法

為降低新制成的毛細(xì)管內(nèi)壁表面硅羥基解離對(duì)電滲產(chǎn)生的影響，在正式實(shí)驗(yàn)前要對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行老化處理，具體過程如下：

先用重蒸水沖洗20min后用0.1mol/L的HCl溶液沖洗30min；再用重蒸水沖洗沖洗5min后，用0.1mol/L的NaOH溶液沖洗30min；最后用電泳緩沖液沖洗20min。

3.2 實(shí)驗(yàn)過程中毛細(xì)管處理方法

在實(shí)驗(yàn)過程中毛細(xì)管柱要經(jīng)常沖洗，每進(jìn)樣一次，需沖洗一遍毛細(xì)管，具體程序如下：

每天在使用前，先用重蒸水沖洗10min后，用0.1mol/L的HCl溶液沖洗10min先用0.1mol/L的NaOH沖洗10min，最后用緩沖液沖洗10min。

在實(shí)驗(yàn)過程中，每進(jìn)樣一次后，要用0.1mol/L的HCI溶液沖洗1min，0.1mol/L的NaOH沖洗1min，最后用緩沖液沖洗1min后才可進(jìn)樣。

當(dāng)出現(xiàn)基線非常不穩(wěn)定或者蛋白質(zhì)吸附情況嚴(yán)重時(shí)，可對(duì)毛細(xì)管再次進(jìn)行老化處理。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后毛細(xì)管處理方法

首先用0.1mol/L的HCl沖洗10min，用重蒸水沖洗5min；再用0.1mol/L的NaOH沖洗10min，重蒸水沖洗5min后將其兩端浸泡于重蒸水中。

4 結(jié)束語

毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)后得出堿-酶法從鉻革屑中提取的膠原蛋白的平均分子量集中在2300～3300Da之間。酸法水解提取膠原蛋白的研究結(jié)果表明，提取條件為硫酸用量0.3ml（草酸用量8%），反應(yīng)溫度80°C，反應(yīng)時(shí)間2h，此時(shí)膠原蛋白的提取率為80%左右，在毛細(xì)管電泳條件相同的情況下，硫酸和草酸水解提取膠原蛋白的分子量分布大體一致；草酸提取的膠原蛋白可控制其分子量在20kD左右，而硫酸提取的膠原蛋白可控制其分子量在15KDa左右。由以上數(shù)據(jù)可以得出，酸法提取的膠原蛋白可以控制其分子量分布比較集中，分子量的最大含量已經(jīng)達(dá)到60%以上。

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