電針對食源性肥胖大鼠下丘腦自噬相關(guān)蛋白7表達(dá)的影響

姚俊鵬， 李瑛， 張林

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院四川省糖尿病防治中心內(nèi)科，四川成都 610041）

最新的資料發(fā)現(xiàn)中國的肥胖人數(shù)位居世界第一[1]，與肥胖相關(guān)的心腦血管等疾病的患病率呈明顯增加趨勢。針刺治療肥胖切實(shí)有效[2]。越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)，下丘腦內(nèi)自噬與肥胖關(guān)系密切[3]。長期高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖C57BL/6小鼠與正常飲食小鼠相比，下丘腦弓狀核內(nèi)自噬相關(guān)蛋白減少[4]。去血清營養(yǎng)條件下培養(yǎng)下丘腦GT1-7細(xì)胞，自噬表達(dá)增加[5]。本課題從自噬的角度探討針刺治療肥胖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物雄性SD大鼠40只，SPF級，3～4周齡，體質(zhì)量70～90 g，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動物許可證號：SCXK（川）2013-24。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，明暗周期各12 h，自由攝食飲水。

1.2試劑及儀器硝酸纖維素膜，美國Hybond公司；自噬相關(guān)蛋白7（Autophagy-related protein 7，Atg7）抗體，生物素化山羊抗兔IgG（H+L）抗體，英國abcam（上海）貿(mào)易有限公司產(chǎn)品，批號分別為ab133528，ab6721和ab6789；辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素（HRP/A-V），北京中杉金橋生物有限公司，批號：13152A11。DYY-6C電泳儀（美國Bio-RAD公司），UVTransilluminator化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-RAD公司）。

1.3分組和模型制備大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組對照8只（給予基礎(chǔ)飼料）和高脂喂養(yǎng)組32只。高脂飼料配方[6]：脂肪占20%，糖占10%，蛋黃粉占10%，基礎(chǔ)飼料占60%，能量為4 928 kcal·kg-1。所有大鼠自由攝食和飲水，飼養(yǎng)溫度22～24℃，濕度50%～70%，采用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖（diet-induced obesity，DIO）大鼠模型，共飼養(yǎng)14周。肥胖判斷標(biāo)準(zhǔn)為超過正常組平均體質(zhì)量的20%[7]，體質(zhì)量未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)者予以剔除。最后將造模成功的DIO大鼠隨機(jī)分為肥胖模型組和針刺干預(yù)組，每組各8只。

1.4針刺干預(yù)選取天樞（ST25）、三陰交（SP6）、中脘（CV12/RN12）和足三里（ST36）進(jìn)行針刺干預(yù)，穴位定位參照李珂等研究[8]，每天1次，每次20 min，每周連續(xù)5 d，休息2 d，共干預(yù)28 d。電針參數(shù)：0.25 mm×13 mm毫針，18 Hz的頻率，2 mA的強(qiáng)度。

1.5Western blot檢測Atg7蛋白質(zhì)表達(dá)利多卡因腹腔麻醉大鼠后，股動脈放血處死，在冰浴中剝離腦組織后置于液氮罐保存。37℃水浴中解凍后，使用RIPA裂解液提取組織總蛋白，并測定蛋白濃度。根據(jù)所測蛋白濃度，每孔按蛋白量100 μg上樣。進(jìn)行SDS-PAGE電泳：接通電源，穩(wěn)定電壓在100 V，15 min，到分離膠以后將電壓調(diào)至180 V繼續(xù)電泳，當(dāng)溴酚蘭染料到達(dá)凝膠底部時終止電泳。轉(zhuǎn)膜：將凝膠面與負(fù)極相連，硝酸纖維素膜與正極相連，接通電源，200 mA轉(zhuǎn)膜1～2 h。封閉：將硝酸纖維素膜放入用TBST Buffer稀釋的5%BSA液，用保鮮膜封好，搖床上輕搖2 h，轉(zhuǎn)速50～60。孵育抗體：將硝酸纖維素膜放入一抗（Atg7 1∶200）中，4℃過夜；用TBST將硝酸纖維素膜洗3次，每次5 min；將硝酸纖維素膜放入二抗（稀釋濃度1∶5000）中，室溫孵育2～3 h；TBST將硝酸纖維素膜洗3次，每次10 min；將硝酸纖維素膜平鋪到保鮮膜上，ECL顯色，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀的暗室中進(jìn)行曝光。使用Quantity One軟件進(jìn)行光密度測定，以GADPH為內(nèi)參計算各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，同組前后比較采用配對t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1電針干預(yù)前后各組大鼠體質(zhì)量比較高脂喂養(yǎng)14周后，肥胖模型組和針刺干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均明顯升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明造模成功。電針干預(yù)4周后，針刺干預(yù)組大鼠體質(zhì)量明顯降低，與同期肥胖模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第18周時，針刺干預(yù)組大鼠體質(zhì)量與電針干預(yù)14周時大鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2各組大鼠下丘腦Atg7蛋白質(zhì)表達(dá)情況肥胖模型組大鼠下丘腦Atg7蛋白質(zhì)含量明顯低于正常對照組（P＜0.05），電針干預(yù)4周后，針刺干預(yù)組大鼠下丘腦Atg7蛋白質(zhì)含量升高，與肥胖模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1和圖2。

表1 針刺對大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of EA on rat body weight （±s，m/g）

表1 針刺對大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of EA on rat body weight （±s，m/g）

①P＜0.05，與同期正常對照組比較；②P＜0.05，與同期肥胖模型組比較；③P＜0.05，與第14周針刺干預(yù)組比較

第18周409.12±25.83 524.32±26.48①470.95± 26.09②③組別正常對照組肥胖模型組針刺干預(yù)組n8 8 8第14周410.92±26.47 518.00±24.63①520.37±24.16①

圖1 各組大鼠下丘腦Atg7蛋白質(zhì)表達(dá)情況Figure 1 Effect of EA on Atg7 protein expression in hypothalamus of rats in the three groups

圖2 各組大鼠下丘腦Atg7蛋白質(zhì)表達(dá)Figure 2 Atg7 protein expression in the hypothalamus of rats in the three groups

3 討論

針刺可通過中樞和外周機(jī)制減輕體質(zhì)量。研究顯示，針刺可通過調(diào)控下丘腦AMPK信號通路活性減重[9]；針刺可減少腹型肥胖婦女內(nèi)臟和肝臟脂肪含量[10]；其外周機(jī)制可能與調(diào)控脂肪組織的炎癥反應(yīng)[11]、缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)、上調(diào)UCP1[12]等有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，電針干預(yù)肥胖大鼠4周后，大鼠下丘腦Atg7蛋白質(zhì)含量明顯增加。下丘腦自噬基因Atg7的下調(diào)可能與肥胖有關(guān)。本研究結(jié)果表明，高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠造成肥胖狀態(tài)，DIO大鼠下丘腦內(nèi)自噬指標(biāo)活性被抑制。自噬是一種高度保守的自我吞噬消化，是降解細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器的主要機(jī)制之一。作為對肥胖的反應(yīng)，下丘腦對自噬的調(diào)控具有細(xì)胞特異性。研究[13]表明，基礎(chǔ)水平的自噬對維持下丘腦神經(jīng)元的功能非常重要。在AgRP神經(jīng)元中特異性抑制自噬，作為對饑餓的反應(yīng)，生理性增加的神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)被減弱，這上調(diào)了POMC和α-MSH的表達(dá)，從而導(dǎo)致小鼠的瘦表型。Atg7缺失POMC神經(jīng)元引起p62在神經(jīng)元積聚，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，p62蛋白可使自噬體發(fā)生泛素化的多功能蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的增加是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自噬缺失的標(biāo)志。POMC神經(jīng)元內(nèi)自噬缺失引起過度進(jìn)食，能量消耗下降，體質(zhì)量增加[14]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，DIO小鼠下丘腦Atg7蛋白表達(dá)下降47%，下丘腦特異性Atg7敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖狀態(tài)，提示Atg7在飲食誘導(dǎo)肥胖中發(fā)揮著重要作用。參與自噬啟動的unc-51樣自噬激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）和unc-51樣自噬激酶2（unc-51 like autophagy activating kinase 2，ULK2）是Atg7的上游信號[15]。Atg7可激活下游的LC3和Atg5/Atg12復(fù)合物系統(tǒng)，從而促進(jìn)自噬體的形成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)可使DIO大鼠體質(zhì)量顯著降低，伴隨下丘腦自噬基因Atg7的上調(diào)，結(jié)果提示電針減輕肥胖大鼠的體質(zhì)量可能與下丘腦自噬基因Atg7的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。

本研究未對Atg7信號通路進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而觀察針刺對肥胖大鼠體質(zhì)量的影響，未能明確針刺處理與Atg7蛋白質(zhì)表達(dá)改變之間的因果關(guān)系。今后的實(shí)驗(yàn)中將在該信號通路進(jìn)行干預(yù)的基礎(chǔ)上，檢測Atg7及其上下游基因的變化，以進(jìn)一步明確針刺減重的中樞自噬機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠造成肥胖狀態(tài)，DIO大鼠下丘腦內(nèi)自噬水平下調(diào)，針刺干預(yù)可能通過上調(diào)下丘腦自噬基因Atg7的水平降低大鼠體質(zhì)量。