蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1減輕小鼠肝臟缺血再灌注所致的肺損傷*

方虹儀， 程 楠, 謝漢鑌, 羅晨芳

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科， 廣東 廣州 510630)

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia/reperfusion injury，HI/RI)不僅是肝移植和肝部分切除術(shù)后引起急性肝衰竭和慢性肝功能損害的主要原因[1-2]，還常引起遠(yuǎn)端器官損傷，其中肝IR導(dǎo)致急性肺損傷增加了肝移植術(shù)后的死亡率，是一個(gè)亟待解決的臨床難題[3]。肝移植術(shù)后急性肺損傷發(fā)生率約27.5%，5.5%患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[4]，具體的機(jī)制尚未完全研究清楚。有研究認(rèn)為肥大細(xì)胞激活在多種急性肺損傷過程中發(fā)揮了重要作用[5-6]，但目前臨床上并沒有HI/RI肺損傷的有效預(yù)防措施，也沒有通過抑制肥大細(xì)胞功能取得良好療效并應(yīng)用于臨床的藥物和方法。

Rab鳥嘌呤核苷酸交換因子1(Rab guanine nucleotide exchange factor 1, RabGEF1)是一類主要在肥大細(xì)胞中表達(dá)并參與胞吞途徑的調(diào)整蛋白，與肥大細(xì)胞的激活抑制相關(guān)。Tam等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，RabGEF1-/-基因缺陷小鼠中肥大細(xì)胞數(shù)量及組胺濃度升高，炎癥損傷加重，證明RabGEF1可抑制肥大細(xì)胞激活。因此，我們提出假設(shè)：RabGEF1蛋白可能通過抑制肥大細(xì)胞激活達(dá)到減輕肝臟缺血再灌注所致肺損傷的作用?；谶@一假設(shè)，前期我們構(gòu)建了RabGEF1和轉(zhuǎn)錄反式激活因子[8](trans-activator of transcription，TAT)融合蛋白(Tat-RabGEF1)，驗(yàn)證了該蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞的活性[9]。本項(xiàng)工作探討這一蛋白在小鼠體內(nèi)能否抑制組織炎癥反應(yīng)，從而減輕肝臟缺血再灌注所致的肺損傷，并初步分析其對(duì)肺肥大細(xì)胞的效應(yīng)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康雄性C57BL/6小鼠，體重21～24 g，6～8周齡，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。Tat-RabGEF1(液態(tài)，無色透明，1 g/L,-80 ℃保存)在前期已由本實(shí)驗(yàn)室通過基因工程成功制備；小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司；β-氨基己糖苷酶A(β-hexosaminidase A,β-Hex A)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)ELISA試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；類胰蛋白酶(tryptase)抗體購(gòu)于Santa Cruz。

2 方法

2.1小鼠肝IR模型的制備 術(shù)前禁食12 h，自由進(jìn)水，戊巴比妥鈉(45～50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，仰臥位固定于恒溫加熱板。取中線開腹，以無損傷血管夾夾閉通往肝左葉及肝中葉(約占整個(gè)肝臟質(zhì)量的70%)的肝蒂，包括門靜脈、肝動(dòng)脈和膽道(此時(shí)可見肝左葉及中葉的顏色變暗灰，注意不要影響肝右葉及尾狀葉血流)。無菌生理鹽水紗布覆蓋腹部切口。缺血90 min后撤離無損傷血管夾，恢復(fù)血流(可見缺血肝葉顏色由暗灰變?yōu)榘导t)，開始再灌注，逐層關(guān)腹。

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 24只C57BL/6小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(sham)組、IR組和Tat-RabGEF1組，每組8只。Sham組小鼠僅接受麻醉、開腹及關(guān)腹操作；IR組及Tat-RabGEF1組小鼠建立肝臟IR模型，Tat-RabGEF1組于再灌注即刻經(jīng)尾靜脈注射Tat-RabGEF1(10 mg/kg)，IR組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

2.3標(biāo)本采集 再灌注后4 h處死小鼠，用1 mL生理鹽水經(jīng)氣管導(dǎo)管行左肺灌洗，共3次，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，離心取上清液，-80 ℃凍存，用于檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β濃度；收集右上肺并用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變；右中肺用于檢測(cè)肺組織濕/干重比；右下肺制備組織勻漿，用于檢測(cè)β-Hex A和MPO水平以及類胰蛋白酶表達(dá)。

2.4肺組織濕/干重比 獲取小鼠右中肺后，濾紙擦干肺表面液體，立即稱重(濕重)；再置于80 ℃恒溫箱烤72 h至恒重，稱量干重,計(jì)算濕/干重比。

2.5ELISA檢測(cè) 肺泡灌洗液內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β的含量以及肺組織β-Hex A和MPO檢測(cè)采用相應(yīng)的ELISA試劑盒并按照說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。

2.6Western blot檢測(cè) 肺組織加入蛋白裂解液，在冰浴中充分勻漿后，于4 ℃、12 000×g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中，準(zhǔn)備定量或存于-80 ℃冰箱。測(cè)定類胰蛋白酶的蛋白含量。常規(guī)配制10%凝膠并放入電泳槽中，檢測(cè)樣品量為30 μg。恒壓90 V開始電泳，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，將電壓提高到100 V，繼續(xù)電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部。切取含有目的條帶和β-actin蛋白的凝膠，100 V、90 min轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜放入5% 脫脂奶粉/TBST 液中于37 ℃封閉2 h。1∶500稀釋的抗類胰蛋白酶抗體和 1∶5 000 稀釋的抗β-actin 單克隆抗體與PVDF膜孵育過夜。充分洗膜3次后，孵育Ⅱ抗。充分洗膜，并在暗室中曝光、顯影、定影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用方差分析，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺損傷及評(píng)分

Sham組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯炎性滲出和細(xì)胞浸潤(rùn)；與之比較，IR組小鼠肺組織病理?yè)p傷明顯，肺小血管充血，肺泡破裂、大小不一，紅色滲出液增多，肺間質(zhì)增厚水腫，可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)彌漫；與sham組相比，IR組損傷評(píng)分和肺組織濕/干比顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，Tat-RabGEF1組肺組織病理?yè)p傷減輕、損傷評(píng)分及肺組織濕/干比顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The photomicrographs of lung tissues, lung injury scores, and lung wet/dry weight ratios of the three groups. A: the photomicrographs of lung tissues (HE staining); B: lung injury scores; C: lung wet/dry weight ratios.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsIR group.

圖13組小鼠肺病理圖片、損傷評(píng)分及肺組織濕/干重比

2 BALF中細(xì)胞因子水平

與sham組比較，IR后BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，Tat-RabGEF1組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05),見圖2。

3 肺組織中β-Hex A和MPO水平

與sham組比較，IR后肺組織β-Hex A和MPO水平顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，Tat-RabGEF1組β-Hex A和MPO水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 肺組織中類胰蛋白酶表達(dá)

與sham組比較，IR后肺組織類胰蛋白酶表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與IR組比較，Tat-RabGEF1組類胰蛋白酶表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

討 論

小鼠肝部分缺血再灌注模型通過部分夾閉肝蒂，主要中斷肝左葉和中葉(約占肝臟體積的70%)的血液供應(yīng)，這一模型部分鉗夾允許門靜脈通過剩余的肝段，有助于延長(zhǎng)缺血時(shí)間并防止嚴(yán)重腸系膜充血，從而減少細(xì)菌移位[10]和內(nèi)毒素釋放入血[11],且減少繼發(fā)于腸系膜淤滯的炎癥介質(zhì)的干擾。它廣泛應(yīng)用于諸多研究，造?？傮w成功率可達(dá)到91.7%[12]。根據(jù)既往研究[13]及本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，選擇肝臟缺血90 min、再灌注4 h的方法構(gòu)建肝臟缺血再灌注損傷模型，小鼠存活率為100%，產(chǎn)生一定程度肺損傷的成功率約80%。肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制與氧自由基生成過多、促炎因子大量釋放引起炎癥爆發(fā)有關(guān)[14]，這些產(chǎn)物在再灌注階段通過血液循環(huán)進(jìn)入全身多個(gè)器官，引起遠(yuǎn)端器官組織炎癥和結(jié)構(gòu)破壞。TNF-α[15]、IL-6[16]和 IL-1β[17]在多項(xiàng)研究中被證實(shí)介導(dǎo)了器官缺血再灌注損害后ALI和ARDS過程，其水平高低與肺損傷程度相關(guān)[18]。MPO來源于激活的中性粒細(xì)胞，是氧化應(yīng)激時(shí)表達(dá)的氧化還原酶，通過催化次氯酸、硝基化自由基和氯胺促進(jìn)H2O2的氧化能力[19]，反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝臟缺血再灌注4 h肝臟病理切片中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎性滲出水腫明顯；急性肺損傷嚴(yán)重，組織病理切片肺小血管充血，肺泡破裂、滲出增多，肺間質(zhì)水腫、增厚，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)彌漫。肺濕/干重比增高，說明肝IR引起的肺損傷模型復(fù)制成功。IR組血清和BALF中促炎細(xì)胞因子水平高于正常組，與肺組織病理評(píng)分升高結(jié)果一致，進(jìn)一步表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是肝臟缺血再灌注后肺損傷的重要機(jī)制。對(duì)比RabGEF1組和IR組，不僅肺組織病理?yè)p傷減輕，且伴隨著細(xì)胞因子和MPO水平下降，提示蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1有助于緩解肝IR后急性肺損傷以及氧化應(yīng)激/炎癥爆發(fā)的程度。

Figure 2.The levels of cytokines in BALF. A: TNF-α; B: IL-6; C: IL-1β. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsIR group.

圖2BALF中細(xì)胞因子水平

Figure 3.The levels of β-Hex A and MPO in lung tissues of the three groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsIR group.

圖3肺組織β-HexA和MPO水平

先前研究表明，肥大細(xì)胞激活釋放類胰蛋白酶和多種細(xì)胞因子參與腸[20]缺血再灌注損傷，自體原位肝移植肺損傷過程[18]和腦缺血再灌注損傷[21]。IR引起的炎癥反應(yīng)促使肥大細(xì)胞激活脫顆粒大量釋放類胰蛋白酶[22]，在炎癥反應(yīng)中類胰蛋白酶不僅刺激外周T細(xì)胞、單核細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等，而且促進(jìn)相鄰肥大細(xì)胞激活，形成肥大細(xì)胞激活“瀑布”現(xiàn)象[23]，進(jìn)一步加重IR炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。肥大細(xì)胞加重肺損傷其更深入的機(jī)制可能是通過釋放的類胰蛋白酶或細(xì)胞因子激活蛋白酶激活受體2介導(dǎo)損傷，或通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子 1表達(dá)而促進(jìn)白細(xì)胞的活化[24]。β-Hex A是肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放的一種活性介質(zhì)，相比于組胺的不穩(wěn)定性，是較好的肥大細(xì)胞脫顆粒測(cè)量指標(biāo)[25]。類胰蛋白酶作為肥大細(xì)胞含量最高的活性介質(zhì)，只有在肥大細(xì)胞激活時(shí)大量釋放，也是肥大細(xì)胞激活脫顆粒的重要標(biāo)記物[22]。為進(jìn)一步探討，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織類胰蛋白酶和β-Hex A釋放水平，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組顯著低于IR組，這提示Tat-RabGEF1可能是通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入肥大細(xì)胞內(nèi)，起到抑制肥大細(xì)胞激活從而減弱肝臟缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步惡化的功效。

Figure 4.The expression of tryptase in lung tissue. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsIR group.

圖4肺組織中類胰蛋白酶的表達(dá)

前期已由基因工程成功構(gòu)建了含Tat-RabGEF1的重組質(zhì)粒并表達(dá)了高純度融合蛋白Tat-RabGEF1，并通過免疫熒光標(biāo)記證實(shí)該融合蛋白利用天然存在的Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域在體外可安全有效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肥大細(xì)胞內(nèi)，不存在細(xì)胞毒性[9]。既往研究表明，RabGEF1是肥大細(xì)胞表達(dá)的一種鳥苷酸交換因子，具有抑制失活狀態(tài)的GDP-RAS向激活狀態(tài)的GTP-RAS轉(zhuǎn)變，促進(jìn)GTP-RAS轉(zhuǎn)變成GDP-RAS的功能[26]，這是肥大細(xì)胞激活途徑中的中心環(huán)節(jié)，因此產(chǎn)生抑制肥大細(xì)胞激活的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明融合蛋白Tat-RabGEF1注入小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了肥大細(xì)胞激活的抑制效應(yīng)是此蛋白對(duì)肝缺血再灌注肺損傷模型保護(hù)作用的可能機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)尚未追蹤尾靜脈注射Tat-RabGEF1后蛋白在小鼠體內(nèi)和肥大細(xì)胞內(nèi)的位置及探討融合蛋白對(duì)胞內(nèi)信號(hào)通路的作用，有待今后深入研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1可以有效減輕小鼠肝缺血再灌注急性肺損傷程度，減少多種炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá)；其機(jī)制可能與RabGEF1轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肥大細(xì)胞內(nèi)抑制肥大細(xì)胞激活途徑有關(guān)；這一蛋白在體內(nèi)的作用機(jī)制和安全性，值得深入研究以幫助防治肝移植或肝部分切除術(shù)后肺損傷新型藥物的開發(fā)。