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    蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1減輕小鼠肝臟缺血再灌注所致的肺損傷*

    2019-02-28 09:13:28方虹儀謝漢鑌羅晨芳
    中國(guó)病理生理雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:肥大細(xì)胞肝移植細(xì)胞因子

    方虹儀, 程 楠, 謝漢鑌, 羅晨芳

    (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科, 廣東 廣州 510630)

    肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia/reperfusion injury,HI/RI)不僅是肝移植和肝部分切除術(shù)后引起急性肝衰竭和慢性肝功能損害的主要原因[1-2],還常引起遠(yuǎn)端器官損傷,其中肝IR導(dǎo)致急性肺損傷增加了肝移植術(shù)后的死亡率,是一個(gè)亟待解決的臨床難題[3]。肝移植術(shù)后急性肺損傷發(fā)生率約27.5%,5.5%患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[4],具體的機(jī)制尚未完全研究清楚。有研究認(rèn)為肥大細(xì)胞激活在多種急性肺損傷過程中發(fā)揮了重要作用[5-6],但目前臨床上并沒有HI/RI肺損傷的有效預(yù)防措施,也沒有通過抑制肥大細(xì)胞功能取得良好療效并應(yīng)用于臨床的藥物和方法。

    Rab鳥嘌呤核苷酸交換因子1(Rab guanine nucleotide exchange factor 1, RabGEF1)是一類主要在肥大細(xì)胞中表達(dá)并參與胞吞途徑的調(diào)整蛋白,與肥大細(xì)胞的激活抑制相關(guān)。Tam等[7]研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,RabGEF1-/-基因缺陷小鼠中肥大細(xì)胞數(shù)量及組胺濃度升高,炎癥損傷加重,證明RabGEF1可抑制肥大細(xì)胞激活。因此,我們提出假設(shè):RabGEF1蛋白可能通過抑制肥大細(xì)胞激活達(dá)到減輕肝臟缺血再灌注所致肺損傷的作用?;谶@一假設(shè),前期我們構(gòu)建了RabGEF1和轉(zhuǎn)錄反式激活因子[8](trans-activator of transcription,TAT)融合蛋白(Tat-RabGEF1),驗(yàn)證了該蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞的活性[9]。本項(xiàng)工作探討這一蛋白在小鼠體內(nèi)能否抑制組織炎癥反應(yīng),從而減輕肝臟缺血再灌注所致的肺損傷,并初步分析其對(duì)肺肥大細(xì)胞的效應(yīng)。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

    健康雄性C57BL/6小鼠,體重21~24 g,6~8周齡,購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF環(huán)境飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水。Tat-RabGEF1(液態(tài),無色透明,1 g/L,-80 ℃保存)在前期已由本實(shí)驗(yàn)室通過基因工程成功制備;小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司;β-氨基己糖苷酶A(β-hexosaminidase A,β-Hex A)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)ELISA試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;類胰蛋白酶(tryptase)抗體購(gòu)于Santa Cruz。

    2 方法

    2.1小鼠肝IR模型的制備 術(shù)前禁食12 h,自由進(jìn)水,戊巴比妥鈉(45~50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,仰臥位固定于恒溫加熱板。取中線開腹,以無損傷血管夾夾閉通往肝左葉及肝中葉(約占整個(gè)肝臟質(zhì)量的70%)的肝蒂,包括門靜脈、肝動(dòng)脈和膽道(此時(shí)可見肝左葉及中葉的顏色變暗灰,注意不要影響肝右葉及尾狀葉血流)。無菌生理鹽水紗布覆蓋腹部切口。缺血90 min后撤離無損傷血管夾,恢復(fù)血流(可見缺血肝葉顏色由暗灰變?yōu)榘导t),開始再灌注,逐層關(guān)腹。

    2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 24只C57BL/6小鼠,按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(sham)組、IR組和Tat-RabGEF1組,每組8只。Sham組小鼠僅接受麻醉、開腹及關(guān)腹操作;IR組及Tat-RabGEF1組小鼠建立肝臟IR模型,Tat-RabGEF1組于再灌注即刻經(jīng)尾靜脈注射Tat-RabGEF1(10 mg/kg),IR組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

    2.3標(biāo)本采集 再灌注后4 h處死小鼠,用1 mL生理鹽水經(jīng)氣管導(dǎo)管行左肺灌洗,共3次,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),離心取上清液,-80 ℃凍存,用于檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β濃度;收集右上肺并用10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理改變;右中肺用于檢測(cè)肺組織濕/干重比;右下肺制備組織勻漿,用于檢測(cè)β-Hex A和MPO水平以及類胰蛋白酶表達(dá)。

    2.4肺組織濕/干重比 獲取小鼠右中肺后,濾紙擦干肺表面液體,立即稱重(濕重);再置于80 ℃恒溫箱烤72 h至恒重,稱量干重,計(jì)算濕/干重比。

    2.5ELISA檢測(cè) 肺泡灌洗液內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β的含量以及肺組織β-Hex A和MPO檢測(cè)采用相應(yīng)的ELISA試劑盒并按照說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。

    2.6Western blot檢測(cè) 肺組織加入蛋白裂解液,在冰浴中充分勻漿后,于4 ℃、12 000×g離心30 min,轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中,準(zhǔn)備定量或存于-80 ℃冰箱。測(cè)定類胰蛋白酶的蛋白含量。常規(guī)配制10%凝膠并放入電泳槽中,檢測(cè)樣品量為30 μg。恒壓90 V開始電泳,當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后,將電壓提高到100 V,繼續(xù)電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部。切取含有目的條帶和β-actin蛋白的凝膠,100 V、90 min轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜放入5% 脫脂奶粉/TBST 液中于37 ℃封閉2 h。1∶500稀釋的抗類胰蛋白酶抗體和 1∶5 000 稀釋的抗β-actin 單克隆抗體與PVDF膜孵育過夜。充分洗膜3次后,孵育Ⅱ抗。充分洗膜,并在暗室中曝光、顯影、定影。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用方差分析,兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 肺損傷及評(píng)分

    Sham組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,未見明顯炎性滲出和細(xì)胞浸潤(rùn);與之比較,IR組小鼠肺組織病理?yè)p傷明顯,肺小血管充血,肺泡破裂、大小不一,紅色滲出液增多,肺間質(zhì)增厚水腫,可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)彌漫;與sham組相比,IR組損傷評(píng)分和肺組織濕/干比顯著升高(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組肺組織病理?yè)p傷減輕、損傷評(píng)分及肺組織濕/干比顯著降低(P<0.05),見圖1。

    Figure 1.The photomicrographs of lung tissues, lung injury scores, and lung wet/dry weight ratios of the three groups. A: the photomicrographs of lung tissues (HE staining); B: lung injury scores; C: lung wet/dry weight ratios.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖13組小鼠肺病理圖片、損傷評(píng)分及肺組織濕/干重比

    2 BALF中細(xì)胞因子水平

    與sham組比較,IR后BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05),見圖2。

    3 肺組織中β-Hex A和MPO水平

    與sham組比較,IR后肺組織β-Hex A和MPO水平顯著升高(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組β-Hex A和MPO水平顯著降低(P<0.05),見圖3。

    4 肺組織中類胰蛋白酶表達(dá)

    與sham組比較,IR后肺組織類胰蛋白酶表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組類胰蛋白酶表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖4。

    討 論

    小鼠肝部分缺血再灌注模型通過部分夾閉肝蒂,主要中斷肝左葉和中葉(約占肝臟體積的70%)的血液供應(yīng),這一模型部分鉗夾允許門靜脈通過剩余的肝段,有助于延長(zhǎng)缺血時(shí)間并防止嚴(yán)重腸系膜充血,從而減少細(xì)菌移位[10]和內(nèi)毒素釋放入血[11],且減少繼發(fā)于腸系膜淤滯的炎癥介質(zhì)的干擾。它廣泛應(yīng)用于諸多研究,造??傮w成功率可達(dá)到91.7%[12]。根據(jù)既往研究[13]及本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),選擇肝臟缺血90 min、再灌注4 h的方法構(gòu)建肝臟缺血再灌注損傷模型,小鼠存活率為100%,產(chǎn)生一定程度肺損傷的成功率約80%。肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制與氧自由基生成過多、促炎因子大量釋放引起炎癥爆發(fā)有關(guān)[14],這些產(chǎn)物在再灌注階段通過血液循環(huán)進(jìn)入全身多個(gè)器官,引起遠(yuǎn)端器官組織炎癥和結(jié)構(gòu)破壞。TNF-α[15]、IL-6[16]和 IL-1β[17]在多項(xiàng)研究中被證實(shí)介導(dǎo)了器官缺血再灌注損害后ALI和ARDS過程,其水平高低與肺損傷程度相關(guān)[18]。MPO來源于激活的中性粒細(xì)胞,是氧化應(yīng)激時(shí)表達(dá)的氧化還原酶,通過催化次氯酸、硝基化自由基和氯胺促進(jìn)H2O2的氧化能力[19],反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝臟缺血再灌注4 h肝臟病理切片中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎性滲出水腫明顯;急性肺損傷嚴(yán)重,組織病理切片肺小血管充血,肺泡破裂、滲出增多,肺間質(zhì)水腫、增厚,大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)彌漫。肺濕/干重比增高,說明肝IR引起的肺損傷模型復(fù)制成功。IR組血清和BALF中促炎細(xì)胞因子水平高于正常組,與肺組織病理評(píng)分升高結(jié)果一致,進(jìn)一步表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是肝臟缺血再灌注后肺損傷的重要機(jī)制。對(duì)比RabGEF1組和IR組,不僅肺組織病理?yè)p傷減輕,且伴隨著細(xì)胞因子和MPO水平下降,提示蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1有助于緩解肝IR后急性肺損傷以及氧化應(yīng)激/炎癥爆發(fā)的程度。

    Figure 2.The levels of cytokines in BALF. A: TNF-α; B: IL-6; C: IL-1β. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖2BALF中細(xì)胞因子水平

    Figure 3.The levels of β-Hex A and MPO in lung tissues of the three groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖3肺組織β-HexA和MPO水平

    先前研究表明,肥大細(xì)胞激活釋放類胰蛋白酶和多種細(xì)胞因子參與腸[20]缺血再灌注損傷,自體原位肝移植肺損傷過程[18]和腦缺血再灌注損傷[21]。IR引起的炎癥反應(yīng)促使肥大細(xì)胞激活脫顆粒大量釋放類胰蛋白酶[22],在炎癥反應(yīng)中類胰蛋白酶不僅刺激外周T細(xì)胞、單核細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等,而且促進(jìn)相鄰肥大細(xì)胞激活,形成肥大細(xì)胞激活“瀑布”現(xiàn)象[23],進(jìn)一步加重IR炎癥反應(yīng),形成惡性循環(huán)。肥大細(xì)胞加重肺損傷其更深入的機(jī)制可能是通過釋放的類胰蛋白酶或細(xì)胞因子激活蛋白酶激活受體2介導(dǎo)損傷,或通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子 1表達(dá)而促進(jìn)白細(xì)胞的活化[24]。β-Hex A是肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放的一種活性介質(zhì),相比于組胺的不穩(wěn)定性,是較好的肥大細(xì)胞脫顆粒測(cè)量指標(biāo)[25]。類胰蛋白酶作為肥大細(xì)胞含量最高的活性介質(zhì),只有在肥大細(xì)胞激活時(shí)大量釋放,也是肥大細(xì)胞激活脫顆粒的重要標(biāo)記物[22]。為進(jìn)一步探討,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織類胰蛋白酶和β-Hex A釋放水平,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組顯著低于IR組,這提示Tat-RabGEF1可能是通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入肥大細(xì)胞內(nèi),起到抑制肥大細(xì)胞激活從而減弱肝臟缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步惡化的功效。

    Figure 4.The expression of tryptase in lung tissue. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖4肺組織中類胰蛋白酶的表達(dá)

    前期已由基因工程成功構(gòu)建了含Tat-RabGEF1的重組質(zhì)粒并表達(dá)了高純度融合蛋白Tat-RabGEF1,并通過免疫熒光標(biāo)記證實(shí)該融合蛋白利用天然存在的Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域在體外可安全有效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肥大細(xì)胞內(nèi),不存在細(xì)胞毒性[9]。既往研究表明,RabGEF1是肥大細(xì)胞表達(dá)的一種鳥苷酸交換因子,具有抑制失活狀態(tài)的GDP-RAS向激活狀態(tài)的GTP-RAS轉(zhuǎn)變,促進(jìn)GTP-RAS轉(zhuǎn)變成GDP-RAS的功能[26],這是肥大細(xì)胞激活途徑中的中心環(huán)節(jié),因此產(chǎn)生抑制肥大細(xì)胞激活的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明融合蛋白Tat-RabGEF1注入小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了肥大細(xì)胞激活的抑制效應(yīng)是此蛋白對(duì)肝缺血再灌注肺損傷模型保護(hù)作用的可能機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)尚未追蹤尾靜脈注射Tat-RabGEF1后蛋白在小鼠體內(nèi)和肥大細(xì)胞內(nèi)的位置及探討融合蛋白對(duì)胞內(nèi)信號(hào)通路的作用,有待今后深入研究。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1可以有效減輕小鼠肝缺血再灌注急性肺損傷程度,減少多種炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá);其機(jī)制可能與RabGEF1轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肥大細(xì)胞內(nèi)抑制肥大細(xì)胞激活途徑有關(guān);這一蛋白在體內(nèi)的作用機(jī)制和安全性,值得深入研究以幫助防治肝移植或肝部分切除術(shù)后肺損傷新型藥物的開發(fā)。

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