• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1減輕小鼠肝臟缺血再灌注所致的肺損傷*

    2019-02-28 09:13:28方虹儀謝漢鑌羅晨芳
    中國(guó)病理生理雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:肥大細(xì)胞肝移植細(xì)胞因子

    方虹儀, 程 楠, 謝漢鑌, 羅晨芳

    (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科, 廣東 廣州 510630)

    肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia/reperfusion injury,HI/RI)不僅是肝移植和肝部分切除術(shù)后引起急性肝衰竭和慢性肝功能損害的主要原因[1-2],還常引起遠(yuǎn)端器官損傷,其中肝IR導(dǎo)致急性肺損傷增加了肝移植術(shù)后的死亡率,是一個(gè)亟待解決的臨床難題[3]。肝移植術(shù)后急性肺損傷發(fā)生率約27.5%,5.5%患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[4],具體的機(jī)制尚未完全研究清楚。有研究認(rèn)為肥大細(xì)胞激活在多種急性肺損傷過程中發(fā)揮了重要作用[5-6],但目前臨床上并沒有HI/RI肺損傷的有效預(yù)防措施,也沒有通過抑制肥大細(xì)胞功能取得良好療效并應(yīng)用于臨床的藥物和方法。

    Rab鳥嘌呤核苷酸交換因子1(Rab guanine nucleotide exchange factor 1, RabGEF1)是一類主要在肥大細(xì)胞中表達(dá)并參與胞吞途徑的調(diào)整蛋白,與肥大細(xì)胞的激活抑制相關(guān)。Tam等[7]研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,RabGEF1-/-基因缺陷小鼠中肥大細(xì)胞數(shù)量及組胺濃度升高,炎癥損傷加重,證明RabGEF1可抑制肥大細(xì)胞激活。因此,我們提出假設(shè):RabGEF1蛋白可能通過抑制肥大細(xì)胞激活達(dá)到減輕肝臟缺血再灌注所致肺損傷的作用?;谶@一假設(shè),前期我們構(gòu)建了RabGEF1和轉(zhuǎn)錄反式激活因子[8](trans-activator of transcription,TAT)融合蛋白(Tat-RabGEF1),驗(yàn)證了該蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞的活性[9]。本項(xiàng)工作探討這一蛋白在小鼠體內(nèi)能否抑制組織炎癥反應(yīng),從而減輕肝臟缺血再灌注所致的肺損傷,并初步分析其對(duì)肺肥大細(xì)胞的效應(yīng)。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

    健康雄性C57BL/6小鼠,體重21~24 g,6~8周齡,購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF環(huán)境飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水。Tat-RabGEF1(液態(tài),無色透明,1 g/L,-80 ℃保存)在前期已由本實(shí)驗(yàn)室通過基因工程成功制備;小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司;β-氨基己糖苷酶A(β-hexosaminidase A,β-Hex A)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)ELISA試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;類胰蛋白酶(tryptase)抗體購(gòu)于Santa Cruz。

    2 方法

    2.1小鼠肝IR模型的制備 術(shù)前禁食12 h,自由進(jìn)水,戊巴比妥鈉(45~50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,仰臥位固定于恒溫加熱板。取中線開腹,以無損傷血管夾夾閉通往肝左葉及肝中葉(約占整個(gè)肝臟質(zhì)量的70%)的肝蒂,包括門靜脈、肝動(dòng)脈和膽道(此時(shí)可見肝左葉及中葉的顏色變暗灰,注意不要影響肝右葉及尾狀葉血流)。無菌生理鹽水紗布覆蓋腹部切口。缺血90 min后撤離無損傷血管夾,恢復(fù)血流(可見缺血肝葉顏色由暗灰變?yōu)榘导t),開始再灌注,逐層關(guān)腹。

    2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 24只C57BL/6小鼠,按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(sham)組、IR組和Tat-RabGEF1組,每組8只。Sham組小鼠僅接受麻醉、開腹及關(guān)腹操作;IR組及Tat-RabGEF1組小鼠建立肝臟IR模型,Tat-RabGEF1組于再灌注即刻經(jīng)尾靜脈注射Tat-RabGEF1(10 mg/kg),IR組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

    2.3標(biāo)本采集 再灌注后4 h處死小鼠,用1 mL生理鹽水經(jīng)氣管導(dǎo)管行左肺灌洗,共3次,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),離心取上清液,-80 ℃凍存,用于檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β濃度;收集右上肺并用10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理改變;右中肺用于檢測(cè)肺組織濕/干重比;右下肺制備組織勻漿,用于檢測(cè)β-Hex A和MPO水平以及類胰蛋白酶表達(dá)。

    2.4肺組織濕/干重比 獲取小鼠右中肺后,濾紙擦干肺表面液體,立即稱重(濕重);再置于80 ℃恒溫箱烤72 h至恒重,稱量干重,計(jì)算濕/干重比。

    2.5ELISA檢測(cè) 肺泡灌洗液內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β的含量以及肺組織β-Hex A和MPO檢測(cè)采用相應(yīng)的ELISA試劑盒并按照說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。

    2.6Western blot檢測(cè) 肺組織加入蛋白裂解液,在冰浴中充分勻漿后,于4 ℃、12 000×g離心30 min,轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中,準(zhǔn)備定量或存于-80 ℃冰箱。測(cè)定類胰蛋白酶的蛋白含量。常規(guī)配制10%凝膠并放入電泳槽中,檢測(cè)樣品量為30 μg。恒壓90 V開始電泳,當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后,將電壓提高到100 V,繼續(xù)電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部。切取含有目的條帶和β-actin蛋白的凝膠,100 V、90 min轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜放入5% 脫脂奶粉/TBST 液中于37 ℃封閉2 h。1∶500稀釋的抗類胰蛋白酶抗體和 1∶5 000 稀釋的抗β-actin 單克隆抗體與PVDF膜孵育過夜。充分洗膜3次后,孵育Ⅱ抗。充分洗膜,并在暗室中曝光、顯影、定影。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用方差分析,兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 肺損傷及評(píng)分

    Sham組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,未見明顯炎性滲出和細(xì)胞浸潤(rùn);與之比較,IR組小鼠肺組織病理?yè)p傷明顯,肺小血管充血,肺泡破裂、大小不一,紅色滲出液增多,肺間質(zhì)增厚水腫,可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)彌漫;與sham組相比,IR組損傷評(píng)分和肺組織濕/干比顯著升高(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組肺組織病理?yè)p傷減輕、損傷評(píng)分及肺組織濕/干比顯著降低(P<0.05),見圖1。

    Figure 1.The photomicrographs of lung tissues, lung injury scores, and lung wet/dry weight ratios of the three groups. A: the photomicrographs of lung tissues (HE staining); B: lung injury scores; C: lung wet/dry weight ratios.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖13組小鼠肺病理圖片、損傷評(píng)分及肺組織濕/干重比

    2 BALF中細(xì)胞因子水平

    與sham組比較,IR后BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05),見圖2。

    3 肺組織中β-Hex A和MPO水平

    與sham組比較,IR后肺組織β-Hex A和MPO水平顯著升高(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組β-Hex A和MPO水平顯著降低(P<0.05),見圖3。

    4 肺組織中類胰蛋白酶表達(dá)

    與sham組比較,IR后肺組織類胰蛋白酶表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與IR組比較,Tat-RabGEF1組類胰蛋白酶表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖4。

    討 論

    小鼠肝部分缺血再灌注模型通過部分夾閉肝蒂,主要中斷肝左葉和中葉(約占肝臟體積的70%)的血液供應(yīng),這一模型部分鉗夾允許門靜脈通過剩余的肝段,有助于延長(zhǎng)缺血時(shí)間并防止嚴(yán)重腸系膜充血,從而減少細(xì)菌移位[10]和內(nèi)毒素釋放入血[11],且減少繼發(fā)于腸系膜淤滯的炎癥介質(zhì)的干擾。它廣泛應(yīng)用于諸多研究,造??傮w成功率可達(dá)到91.7%[12]。根據(jù)既往研究[13]及本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),選擇肝臟缺血90 min、再灌注4 h的方法構(gòu)建肝臟缺血再灌注損傷模型,小鼠存活率為100%,產(chǎn)生一定程度肺損傷的成功率約80%。肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制與氧自由基生成過多、促炎因子大量釋放引起炎癥爆發(fā)有關(guān)[14],這些產(chǎn)物在再灌注階段通過血液循環(huán)進(jìn)入全身多個(gè)器官,引起遠(yuǎn)端器官組織炎癥和結(jié)構(gòu)破壞。TNF-α[15]、IL-6[16]和 IL-1β[17]在多項(xiàng)研究中被證實(shí)介導(dǎo)了器官缺血再灌注損害后ALI和ARDS過程,其水平高低與肺損傷程度相關(guān)[18]。MPO來源于激活的中性粒細(xì)胞,是氧化應(yīng)激時(shí)表達(dá)的氧化還原酶,通過催化次氯酸、硝基化自由基和氯胺促進(jìn)H2O2的氧化能力[19],反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝臟缺血再灌注4 h肝臟病理切片中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎性滲出水腫明顯;急性肺損傷嚴(yán)重,組織病理切片肺小血管充血,肺泡破裂、滲出增多,肺間質(zhì)水腫、增厚,大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)彌漫。肺濕/干重比增高,說明肝IR引起的肺損傷模型復(fù)制成功。IR組血清和BALF中促炎細(xì)胞因子水平高于正常組,與肺組織病理評(píng)分升高結(jié)果一致,進(jìn)一步表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是肝臟缺血再灌注后肺損傷的重要機(jī)制。對(duì)比RabGEF1組和IR組,不僅肺組織病理?yè)p傷減輕,且伴隨著細(xì)胞因子和MPO水平下降,提示蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1有助于緩解肝IR后急性肺損傷以及氧化應(yīng)激/炎癥爆發(fā)的程度。

    Figure 2.The levels of cytokines in BALF. A: TNF-α; B: IL-6; C: IL-1β. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖2BALF中細(xì)胞因子水平

    Figure 3.The levels of β-Hex A and MPO in lung tissues of the three groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖3肺組織β-HexA和MPO水平

    先前研究表明,肥大細(xì)胞激活釋放類胰蛋白酶和多種細(xì)胞因子參與腸[20]缺血再灌注損傷,自體原位肝移植肺損傷過程[18]和腦缺血再灌注損傷[21]。IR引起的炎癥反應(yīng)促使肥大細(xì)胞激活脫顆粒大量釋放類胰蛋白酶[22],在炎癥反應(yīng)中類胰蛋白酶不僅刺激外周T細(xì)胞、單核細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等,而且促進(jìn)相鄰肥大細(xì)胞激活,形成肥大細(xì)胞激活“瀑布”現(xiàn)象[23],進(jìn)一步加重IR炎癥反應(yīng),形成惡性循環(huán)。肥大細(xì)胞加重肺損傷其更深入的機(jī)制可能是通過釋放的類胰蛋白酶或細(xì)胞因子激活蛋白酶激活受體2介導(dǎo)損傷,或通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子 1表達(dá)而促進(jìn)白細(xì)胞的活化[24]。β-Hex A是肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放的一種活性介質(zhì),相比于組胺的不穩(wěn)定性,是較好的肥大細(xì)胞脫顆粒測(cè)量指標(biāo)[25]。類胰蛋白酶作為肥大細(xì)胞含量最高的活性介質(zhì),只有在肥大細(xì)胞激活時(shí)大量釋放,也是肥大細(xì)胞激活脫顆粒的重要標(biāo)記物[22]。為進(jìn)一步探討,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織類胰蛋白酶和β-Hex A釋放水平,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組顯著低于IR組,這提示Tat-RabGEF1可能是通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入肥大細(xì)胞內(nèi),起到抑制肥大細(xì)胞激活從而減弱肝臟缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步惡化的功效。

    Figure 4.The expression of tryptase in lung tissue. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

    圖4肺組織中類胰蛋白酶的表達(dá)

    前期已由基因工程成功構(gòu)建了含Tat-RabGEF1的重組質(zhì)粒并表達(dá)了高純度融合蛋白Tat-RabGEF1,并通過免疫熒光標(biāo)記證實(shí)該融合蛋白利用天然存在的Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域在體外可安全有效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肥大細(xì)胞內(nèi),不存在細(xì)胞毒性[9]。既往研究表明,RabGEF1是肥大細(xì)胞表達(dá)的一種鳥苷酸交換因子,具有抑制失活狀態(tài)的GDP-RAS向激活狀態(tài)的GTP-RAS轉(zhuǎn)變,促進(jìn)GTP-RAS轉(zhuǎn)變成GDP-RAS的功能[26],這是肥大細(xì)胞激活途徑中的中心環(huán)節(jié),因此產(chǎn)生抑制肥大細(xì)胞激活的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明融合蛋白Tat-RabGEF1注入小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了肥大細(xì)胞激活的抑制效應(yīng)是此蛋白對(duì)肝缺血再灌注肺損傷模型保護(hù)作用的可能機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)尚未追蹤尾靜脈注射Tat-RabGEF1后蛋白在小鼠體內(nèi)和肥大細(xì)胞內(nèi)的位置及探討融合蛋白對(duì)胞內(nèi)信號(hào)通路的作用,有待今后深入研究。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)RabGEF1可以有效減輕小鼠肝缺血再灌注急性肺損傷程度,減少多種炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá);其機(jī)制可能與RabGEF1轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肥大細(xì)胞內(nèi)抑制肥大細(xì)胞激活途徑有關(guān);這一蛋白在體內(nèi)的作用機(jī)制和安全性,值得深入研究以幫助防治肝移植或肝部分切除術(shù)后肺損傷新型藥物的開發(fā)。

    猜你喜歡
    肥大細(xì)胞肝移植細(xì)胞因子
    抗GD2抗體聯(lián)合細(xì)胞因子在高危NB治療中的研究進(jìn)展
    《大鼠及小鼠原代肥大細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)》圖版
    急性心肌梗死病人細(xì)胞因子表達(dá)及臨床意義
    細(xì)胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過程中的作用
    肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的研究現(xiàn)狀
    肝移植術(shù)后患者的健康之路
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:45
    肥大細(xì)胞在抗感染免疫作用中的研究進(jìn)展
    細(xì)胞因子在抗病毒免疫中作用的研究進(jìn)展
    肥大細(xì)胞與腎臟疾病
    肝移植75例術(shù)后近期處理體會(huì)
    亚洲国产看品久久| 亚洲九九香蕉| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩电影二区| 男女下面插进去视频免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲精品一区蜜桃| 免费看不卡的av| 亚洲男人天堂网一区| 岛国毛片在线播放| 国产爽快片一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲欧美激情在线| 在线观看www视频免费| 麻豆乱淫一区二区| 激情视频va一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲色图综合在线观看| 蜜桃国产av成人99| www.av在线官网国产| 成人手机av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 好男人视频免费观看在线| 老司机在亚洲福利影院| 秋霞在线观看毛片| 少妇 在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 男男h啪啪无遮挡| 好男人视频免费观看在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 人妻人人澡人人爽人人| 婷婷色综合www| 下体分泌物呈黄色| 国产黄色视频一区二区在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品 国内视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜日韩欧美国产| 午夜福利视频在线观看免费| av网站免费在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx| 咕卡用的链子| 国产真人三级小视频在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产成人a∨麻豆精品| 欧美日韩黄片免| 午夜福利,免费看| 中文欧美无线码| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品免费视频内射| 亚洲av美国av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 99久久综合免费| 丝瓜视频免费看黄片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 美女主播在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 好男人电影高清在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 观看av在线不卡| 丁香六月欧美| 丁香六月天网| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人av激情在线播放| 久久久精品区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 七月丁香在线播放| 丰满少妇做爰视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久99一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 秋霞在线观看毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 黑人猛操日本美女一级片| 精品福利观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人av教育| 99久久综合免费| 午夜福利视频在线观看免费| 老鸭窝网址在线观看| 成人国产av品久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产成人欧美在线观看 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产xxxxx性猛交| 国产精品国产av在线观看| 九草在线视频观看| 男女免费视频国产| 少妇人妻 视频| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美黑人精品巨大| 99香蕉大伊视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 91成人精品电影| 大陆偷拍与自拍| 亚洲人成电影观看| 国产97色在线日韩免费| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品在线美女| 美女午夜性视频免费| 久久天堂一区二区三区四区| 女性生殖器流出的白浆| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产成人免费观看mmmm| 亚洲情色 制服丝袜| 一级黄片播放器| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av美国av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 视频在线观看一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产三级黄色录像| 免费观看av网站的网址| 51午夜福利影视在线观看| 免费看十八禁软件| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产高清videossex| 亚洲精品国产av成人精品| 国产亚洲一区二区精品| 下体分泌物呈黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲人成网站在线观看播放| av有码第一页| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 亚洲国产精品999| 只有这里有精品99| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | av在线app专区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久热这里只有精品99| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 男女免费视频国产| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 男女之事视频高清在线观看 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久免费观看电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 少妇粗大呻吟视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 中文字幕制服av| 久久中文字幕一级| 国产一区二区 视频在线| 国产深夜福利视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人精品久久二区二区免费| kizo精华| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久久精品精品| 丁香六月天网| 99香蕉大伊视频| www日本在线高清视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 十分钟在线观看高清视频www| 午夜激情av网站| 91精品三级在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 国产日韩欧美视频二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产精品一区三区| 新久久久久国产一级毛片| 电影成人av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美久久黑人一区二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 高清欧美精品videossex| 国产不卡av网站在线观看| 国产一区二区在线观看av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费观看人在逋| 青青草视频在线视频观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 青草久久国产| 欧美性长视频在线观看| 国产在线视频一区二区| 免费av中文字幕在线| 超碰97精品在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| svipshipincom国产片| 18禁观看日本| 国产一区二区三区av在线| 2021少妇久久久久久久久久久| 尾随美女入室| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜两性在线视频| 在线看a的网站| 色视频在线一区二区三区| 超碰97精品在线观看| www.精华液| 一区二区三区四区激情视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品国产综合久久久| 搡老岳熟女国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 美女主播在线视频| 青青草视频在线视频观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成人手机av| svipshipincom国产片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一区福利在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品人妻久久久影院| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 欧美日韩成人在线一区二区| 免费av中文字幕在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 只有这里有精品99| 天堂8中文在线网| 成年av动漫网址| 久久99一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 老熟女久久久| 日本色播在线视频| 性色av一级| 国产免费福利视频在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲av美国av| 中文字幕最新亚洲高清| 天天影视国产精品| 亚洲av男天堂| 久久久久久人人人人人| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美日韩综合久久久久久| 黄片播放在线免费| 亚洲 国产 在线| 久久免费观看电影| www日本在线高清视频| 午夜福利免费观看在线| 天堂8中文在线网| 精品人妻在线不人妻| 午夜老司机福利片| 咕卡用的链子| 国产精品久久久av美女十八| 精品福利永久在线观看| 制服诱惑二区| 欧美大码av| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产精品999| 69精品国产乱码久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 天天添夜夜摸| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲一区二区三区欧美精品| 香蕉国产在线看| 日日爽夜夜爽网站| 18禁观看日本| 一级黄片播放器| 亚洲视频免费观看视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级片'在线观看视频| 精品福利观看| 亚洲av美国av| bbb黄色大片| 9191精品国产免费久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产有黄有色有爽视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产xxxxx性猛交| 丝袜人妻中文字幕| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品久久久久久精品古装| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 一本综合久久免费| 91成人精品电影| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 99国产精品99久久久久| 国产成人欧美| 欧美激情高清一区二区三区| 精品第一国产精品| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜免费鲁丝| 亚洲国产看品久久| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产91精品成人一区二区三区 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲国产最新在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成人影院久久| 午夜免费观看性视频| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品人妻1区二区| 少妇人妻 视频| 久久久久久久国产电影| 中文字幕人妻熟女乱码| 成人国产一区最新在线观看 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费不卡黄色视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 在线观看免费高清a一片| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品av麻豆狂野| 91成人精品电影| 丝袜人妻中文字幕| av在线播放精品| 国产日韩欧美在线精品| 91国产中文字幕| 日日夜夜操网爽| 极品少妇高潮喷水抽搐| 男女边摸边吃奶| 丁香六月欧美| 搡老岳熟女国产| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日本欧美视频一区| 18在线观看网站| netflix在线观看网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲熟女精品中文字幕| 水蜜桃什么品种好| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美日韩av久久| 伊人亚洲综合成人网| 欧美日韩av久久| 国产成人精品久久二区二区91| 精品少妇内射三级| 蜜桃在线观看..| 七月丁香在线播放| 99热全是精品| 欧美精品一区二区免费开放| 99久久综合免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜老司机福利片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲,欧美精品.| 日本vs欧美在线观看视频| 一级a爱视频在线免费观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人国产av品久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜福利视频精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美性长视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美日韩av久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产精品一国产av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 婷婷丁香在线五月| 国产又色又爽无遮挡免| 久久青草综合色| 亚洲一区中文字幕在线| 日本a在线网址| 久久久久网色| 麻豆av在线久日| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产高清视频在线播放一区 | 在线av久久热| 免费在线观看影片大全网站 | 99久久精品国产亚洲精品| av电影中文网址| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av成人精品一二三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 丝袜美腿诱惑在线| 男女边吃奶边做爰视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线av久久热| 亚洲人成网站在线观看播放| 一级毛片女人18水好多 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩一本色道免费dvd| 韩国高清视频一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲 国产 在线| 国产97色在线日韩免费| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色视频在线一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久这里只有精品19| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久久精品人妻al黑| 91精品国产国语对白视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 午夜精品国产一区二区电影| e午夜精品久久久久久久| 久久狼人影院| 91老司机精品| 欧美日韩综合久久久久久| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线av久久热| kizo精华| 色播在线永久视频| 精品福利永久在线观看| 蜜桃国产av成人99| 国产97色在线日韩免费| 热99久久久久精品小说推荐| 久久青草综合色| 亚洲九九香蕉| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 99热国产这里只有精品6| tube8黄色片| 午夜久久久在线观看| 亚洲,欧美精品.| 99国产精品99久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品一二三区在线看| 人人妻人人澡人人看| 午夜福利视频在线观看免费| 搡老乐熟女国产| 女人久久www免费人成看片| 一本综合久久免费| 最新的欧美精品一区二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 丝袜脚勾引网站| 久久性视频一级片| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 91精品三级在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品成人免费网站| 老熟女久久久| 久久久精品94久久精品| www.av在线官网国产| av不卡在线播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 成人国产一区最新在线观看 | 十八禁网站网址无遮挡| 高清欧美精品videossex| 日韩大码丰满熟妇| 日本五十路高清| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 岛国毛片在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 国产一区二区三区av在线| 精品亚洲成国产av| 国产片内射在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久人人爽人人片av| 久久这里只有精品19| 人妻 亚洲 视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 男女免费视频国产| 亚洲欧美一区二区三区国产| 中国美女看黄片| 亚洲五月色婷婷综合| 国产黄色免费在线视频| 久久国产精品影院| 18在线观看网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久国产精品影院| 亚洲精品自拍成人| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 美女主播在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99国产精品一区二区蜜桃av | 大码成人一级视频| 亚洲精品美女久久av网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产色视频综合| 国产成人系列免费观看| 久久综合国产亚洲精品| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲综合色网址| 黄色视频不卡| a级毛片黄视频| 99热国产这里只有精品6| 欧美黑人精品巨大| 亚洲av片天天在线观看| 国产成人影院久久av| 在线观看人妻少妇| 国产一区二区 视频在线| 男女之事视频高清在线观看 | 国产黄色免费在线视频| av在线app专区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费看av在线观看网站| 午夜激情久久久久久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产国语露脸激情在线看| 一区福利在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲人成电影观看| av在线老鸭窝| 日日夜夜操网爽| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产野战对白在线观看| 日本av手机在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩综合久久久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲成色77777| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲国产av影院在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久久国产一级毛片高清牌| av欧美777| svipshipincom国产片| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 人人妻人人澡人人看| 波多野结衣av一区二区av| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲,欧美精品.| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产av精品麻豆| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产黄频视频在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产日韩欧美在线精品| 国产高清国产精品国产三级| 精品少妇黑人巨大在线播放| 91九色精品人成在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 日本a在线网址| 97精品久久久久久久久久精品| 观看av在线不卡| 精品国产乱码久久久久久男人| 97精品久久久久久久久久精品| 国产97色在线日韩免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 老司机在亚洲福利影院| 国产成人91sexporn| 另类亚洲欧美激情| 高清欧美精品videossex| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | a级片在线免费高清观看视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 丝袜美腿诱惑在线| 9热在线视频观看99| 免费人妻精品一区二区三区视频|