Twist通過(guò)ERK通路對(duì)體外鼻咽癌細(xì)胞血管生成的影響*

孫旭鴦， 陳 湧

(1浙江省麗水市中心醫(yī)院耳鼻喉科， 浙江 麗水 323000; 2岳陽(yáng)市二人民醫(yī)院胃腸外科， 湖南 岳陽(yáng) 414000)

鼻咽癌作為一種好發(fā)于鼻咽部咽隱窩和頂前壁黏膜上皮的惡性腫瘤，其病因和遺傳易感性、EB病毒及環(huán)境污染等因素密切相關(guān)。早期鼻咽癌缺乏典型臨床癥狀，同時(shí)鼻咽癌的血供極為豐富，早期就可能發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致鼻咽癌患者的預(yù)后較差。目前尚未鑒定出與鼻咽癌特異性較高的癌基因和抑癌基因，導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)病機(jī)制仍不明確[1-2]。因此，尋找鼻咽癌特異性分子標(biāo)志并從基因水平上抑制促癌基因的表達(dá)或者上調(diào)抑癌基因的表達(dá)，可能對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展起抑制作用。

Twist轉(zhuǎn)錄因子作為主要由胎盤和中胚層組織分泌的細(xì)胞因子，在胎兒時(shí)期呈高表達(dá)，出生后在正常組織中表達(dá)含量極低，其不僅在胚胎發(fā)育成熟過(guò)程中扮演著重要角色，同時(shí)在誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和組織塑性過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。在研究Twist與惡性腫瘤的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，Twist在鼻咽癌、食管癌、骨肉瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織均明顯升高[5-7]；進(jìn)一步分析Twist與惡性腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，Twist可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附因子、促血管生成因子和金屬基質(zhì)蛋白酶等腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和脈管生成等過(guò)程，利于腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。通過(guò)聚類分析和芯片雜交等技術(shù)研究胚胎干細(xì)胞發(fā)育與血管分化的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，Twist可能參與了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、ANG1、PDGF等基因的調(diào)控，從而在血管生成(angiogenesis)過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[8]。既往研究已經(jīng)表明Twist參與多種惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為，目前尚未有Twist與鼻咽癌細(xì)胞血管生成的研究見(jiàn)諸報(bào)道，為此，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)特異性沉默Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)，探討Twist對(duì)體外鼻咽癌細(xì)胞血管生成的影響及其可能作用機(jī)制，為鼻咽癌血管靶向治療提供新的臨床參考。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、無(wú)血清Opti-MEMI培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購(gòu)自Gibco；空載體pEGFP和Twist沉默載體pEGFP-siTwist購(gòu)自北京合生基因科技有限公司；Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購(gòu)自Thermo；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒和RT Master Mix熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa；Twist和GAPDH的上、下游引物由上海英濰捷基公司合成；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自Corning；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD；抗Twist和β-actin抗體購(gòu)自Abcam；抗p-JNK、JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38和VEGF抗體購(gòu)自Epitomics；JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059和p38通路抑制劑SB203580購(gòu)自Sigma。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，細(xì)胞均使用含20%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，細(xì)胞培養(yǎng)箱調(diào)整溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，將細(xì)胞懸液接種于60 mL斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，內(nèi)盛10 mL完全培養(yǎng)基，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)方式為單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)3 d后即可生長(zhǎng)至80%～90%瓶底面積，然后使用含EDTA胰酶進(jìn)行消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)操作。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×109/L，將細(xì)胞懸液接種至6孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞分為TwistsiRNA+Lipofectamine 2000組(siTwist組)、陰性對(duì)照(negative control, NC)+Lipofectamine 2000組(NC組)和空白對(duì)照(blank control, BC)組，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3.2Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) CNE2細(xì)胞提取蛋白后經(jīng)按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白，每份樣品使用20 μg蛋白質(zhì)，使用10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在4 ℃下使用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，硝酸纖維素膜經(jīng)I抗和II抗反應(yīng)后滴加新鮮配置的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

3.3Real-time PCR檢測(cè)Twist mRNA的表達(dá) CNE2細(xì)胞經(jīng)TRIzol作用后提取細(xì)胞總 RNA，利用紫外分光光度儀檢測(cè)稀釋好的RNA標(biāo)本的吸光度(A)值，設(shè)定波長(zhǎng)為260 nm和280 nm，計(jì)算A260/A280比值為1.8～2.1之間。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按real-time PCR說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為： 50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s、80 ℃ 15 s，讀板后重復(fù)44個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。Twist上游引物為5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3’，下游引物為 5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3’；GAPDH上游引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線中繪制的各個(gè)樣本的拷貝數(shù)，以測(cè)定的Twist表達(dá)量與GAPDH表達(dá)量的比值作為基準(zhǔn)來(lái)校準(zhǔn)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

3.4收集鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM) 將CNE2細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基20 mL，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h后收集上清液，以2 500 rpm速度下常溫離心5 min，將上清液用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后，保存于4 ℃冰箱中。

3.5HUVECs與CM共培養(yǎng) 將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)瓶中，加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗2次，加入CM培養(yǎng)24 h。

3.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將HUVECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用胰酶消化并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整濃度為5×107/L，將細(xì)胞懸液接種至96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，在結(jié)束前1 h將10 μL的CCK-8溶液加入96孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h后立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A值，設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm，同時(shí)設(shè)空白調(diào)零組(不加細(xì)胞僅加等量培養(yǎng)基)。

3.7Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel均勻鋪被到Transwell上室底部，待Matrigel完全凝固后，小心取出上室中殘余液體，再加入50 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。調(diào)整HUVECs濃度1×108/L，將200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室中，同時(shí)在Transwell下室中添加500 μL含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將放置培養(yǎng)箱中孵育24 h的Transwell小室取出，去除上室及下室中的培養(yǎng)基，用棉棒小心擦去小室底膜上的細(xì)胞，將Transwell上室放置在10%甲醇溶液中固定20 min，用PBS液清洗3遍后再用結(jié)晶紫溶液染色15 min。將Transwell上室自結(jié)晶紫溶液中取出后，使用PBS溶液清洗3遍，將Transwell上室置于載物片上，放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，在高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野拍照并采集圖像。

3.8小管形成實(shí)驗(yàn) 將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel放置4℃冰箱過(guò)夜預(yù)冷，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel，將250 μL稀釋后的Matrigel加入24孔板中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，至Matrigel凝固。調(diào)整HUVECs濃度為2×105/L，將0.1 mL細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔板中，再放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，最后在倒置顯微鏡下觀察小管形成狀況，利用ImageJ 1.51f軟件對(duì)管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量進(jìn)行定量分析[9]。

3.9JNK、ERK和p38信號(hào)通路抑制劑對(duì)HUVECs小管形成的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置NC組、siTwist組、siTwist+SP600125組、siTwist+PD98059組和siTwist+SB203580組，NC組和siTwist組CNE2細(xì)胞添加PBS作用2 h，后3組分別用10 μmol/L的JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059和p38通路抑制劑SB203580作用CNE2細(xì)胞2 h，提取各組細(xì)胞CM，按照3.8方法檢測(cè)HUVECs小管形成，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有本次實(shí)驗(yàn)所得的計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，率的比較用卡方檢驗(yàn)，采用SNK-q法分析總體及總體中兩樣本均數(shù)之間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Real-time PCR和Western blot檢測(cè)Twist siRNA的干擾效率

將空載體和Twist沉默載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞48 h后，提取各組CNE2細(xì)胞總RNA進(jìn)行real-time PCR以檢測(cè)Twist mRNA的相對(duì)表達(dá)量，NC組和BC組CNE2細(xì)胞中Twist mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.84±0.07和0.87±0.08，與siTwist組(0.17±0.02)相比較顯著升高(P<0.01)，而NC組和BC組之間相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot檢測(cè)Twist蛋白在siTwist組CNE2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為2.32±0.16，與僅轉(zhuǎn)染空載體的CNE2細(xì)胞(6.51±0.52)和BC組細(xì)胞(6.94±0.65)相比較顯著降低(P<0.01)，NC組和BC組之間相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖1。

2 沉默Twist基因?qū)UVECs體外活力的影響

為評(píng)估干擾Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)后對(duì)體外HUVECs活力的影響，分別提取NC組、BC組和siTwist組CNE2細(xì)胞CM，通過(guò)CCK-8法對(duì)HUVECs活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，HUVECs經(jīng)siTwist組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后，A值為0.53±0.13，而HUVECs經(jīng)NC組和BC組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后A值分別為1.49±0.35和1.37±0.24，siTwist組與NC組和BC組相比較顯著降低(P<0.01)，表明沉默Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)可顯著抑制HUVECs活力。

Figure 1.Knockdown ofTwistwas analyzed by Western blot assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖1Westernblot檢測(cè)Twist蛋白在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)水平

3 干擾Twist基因的鼻咽癌細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs侵襲能力的影響

在體外CNE2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染siTwist和空載體后，提取各組細(xì)胞CM，HUVECs經(jīng)CM作用24 h后進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HUVECs經(jīng)siTwist組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后侵襲出Matrigel的細(xì)胞數(shù)較NC組和BC組顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

4 干擾Twist基因的鼻咽癌細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs小管形成的影響

利用小管形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)干擾Twist基因的鼻咽癌細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs的體外血管生成能力，結(jié)果顯示，HUVECs在體外Matrigel基質(zhì)環(huán)境中生長(zhǎng)12 h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長(zhǎng)呈梭形，同時(shí)細(xì)胞延長(zhǎng)端開(kāi)始在Matrigel膠中伸展，相鄰細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。HUVECs經(jīng)siTwist組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后體外小管形成數(shù)較NC組和BC組顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effect ofTwistsilencing on the invasive ability of HUVECsinvitro(×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖2Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默Twist對(duì)HUVECs侵襲能力的影響

Figure 3.The effect ofTwistsilencing on the tube formation of HUVECsinvitro(×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖3小管形成實(shí)驗(yàn)觀察沉默Twist對(duì)HUVECs小管形成的影響

5 Twist對(duì)CNE2細(xì)胞中p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF表達(dá)的影響

分別轉(zhuǎn)染空載體和siTwist至CNE2細(xì)胞后，通過(guò)Western blot檢測(cè)p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，siTwist組CNE2細(xì)胞的ERK磷酸化水平明顯高于NC組和BC組，而VEGF蛋白水平明顯低于NC組和BC組(P<0.01)；下調(diào)Twist在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)p-p38和p-JNK的表達(dá)無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein levels of p-ERK, p-p38, p-JNK and VEGF were assessed by Western blot analysis in the CNE2 cells after transfected with negative control (NC), blank control (BC) and siTwist. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖4Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染siTwist對(duì)CNE2細(xì)胞中p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF表達(dá)的影響

6 ERK、JNK和p38信號(hào)通路抑制劑對(duì)HUVECs體外小管形成的影響

NC組、siTwist組、siTwist+PD98059組、siTwist+SP600125組和siTwist+SB203580組CNE2細(xì)胞所提取CM作用HUVECs后，HUVECs體外小管形成數(shù)分別為48.3±4.2、22.7±3.6、39.1±4.7、25.6±3.3和27.5±2.8。與NC組相比，siTwist組HUVECs體外小管形成數(shù)顯著減少(P<0.01)；與siTwist組相比，siTwist+PD98059組顯著升高(P<0.05)；而siTwist組與siTwist+SP600125組或siTwist+SB203580組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

討 論

Twist作為定位于人類7號(hào)染色體的基因，編碼由202個(gè)氨基酸組成的Twist蛋白。Twist蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)家族成員，首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，這種蛋白在果蠅中胚層的發(fā)育和誘導(dǎo)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Twist在多種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)，Twist可通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而在細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和血管新生中起到重要調(diào)控作用。目前關(guān)于Twist在實(shí)體瘤中的表達(dá)以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究已有較多見(jiàn)諸報(bào)道，但Twist與腫瘤血管新生的相關(guān)性研究較少，尤其是在鼻咽癌中[6-8]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)側(cè)的一層扁平上皮細(xì)胞，在機(jī)體各臟器中分布廣泛，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為組織和血液間的第一道屏障，在細(xì)胞炎癥信號(hào)、切應(yīng)力和激素水平等信號(hào)的作用下，可分泌多種血管活性物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)血液穩(wěn)態(tài)、新生血管形成和組織再生等作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞已成為在機(jī)體多種病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的重要器官。腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織形態(tài)、增生方式和免疫學(xué)特征等方面和正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞存在較大差異，腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為順應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的需要，在腫瘤細(xì)胞分泌的多種促血管生長(zhǎng)因子的作用下，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力、侵襲能力以及新生血管能力均得到不同程度增強(qiáng)，以適應(yīng)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的需要。為此，根據(jù)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)，靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞治療應(yīng)運(yùn)而生，有效抑制包括鼻咽癌在內(nèi)的腫瘤新生血管形成，可有效抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，從而改善惡性腫瘤患者預(yù)后[10-11]。在本研究中，將Twist沉默載體轉(zhuǎn)染至體外CNE2細(xì)胞,并通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)Twist沉默載體可顯著下調(diào)Twist mRNA和蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)，并獲取干擾Twist基因后鼻咽癌細(xì)胞特定培養(yǎng)基，并用該特定培養(yǎng)基作用體外HUVECs，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活力、侵襲能力和血管新生能力進(jìn)行了進(jìn)一步研究。首先，我們利用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析干擾Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)后對(duì)體外HUVECs活力的影響，結(jié)果表明，沉默CNE2細(xì)胞中Twist的表達(dá)后可有效抑制體外HUVECs活力，從而表明Twist在HUVECs體外生長(zhǎng)中發(fā)揮了一定作用。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默Twist的表達(dá)后可有效抑制體外HUVECs侵襲行為。另外通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn)?zāi)MHUVECs體外血管形成，在體外Matrigel基質(zhì)環(huán)境中生長(zhǎng)12 h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長(zhǎng)呈梭形，同時(shí)細(xì)胞延長(zhǎng)端開(kāi)始在Matrigel中伸展，相鄰細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)，低表達(dá)Twist基因的CNE2細(xì)胞上清液可明顯抑制體外HUVECs體外小管形成，從而表明Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平在體外鼻咽癌細(xì)胞促進(jìn)血管新生行為中也發(fā)揮了一定作用，提示Twist可能在鼻咽癌體外血管新生的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)功能，應(yīng)該被視為鼻咽癌潛在的一個(gè)新的靶向作用位點(diǎn)。

Figure 5.Analysis of the tube formation of HUVECs treated with CM from CNE2 cells in siTwist, siTwist+PD98059, siTwist+SP600125 and siTwist+SB203580 groups (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖5小管形成實(shí)驗(yàn)觀察ERK、p38和JNK信號(hào)通路抑制劑對(duì)HUVECs體外小管形成的影響

ERK作為一種脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要位于細(xì)胞漿中，在諸如生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子、高糖和缺氧等刺激后作用下被激活，激活后ERK可進(jìn)入細(xì)胞核中，進(jìn)一步激活NF-κB及P70核蛋白體S6激酶，使得相鄰脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。磷酸化ERK在介導(dǎo)信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，p-ERK可激活STATs、c-Myc、Jun、ELK-1、ATF2和Max等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子各自靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程產(chǎn)生影響，最終對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和増殖等多種生理學(xué)功能發(fā)揮調(diào)控作用[12-14]。SP600125作為ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性抑制劑，可通過(guò)阻斷Raf 對(duì)ERK的磷酸化從而進(jìn)一步阻斷下游信號(hào)通路。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子作為一種在可由正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子，VEGF在正常組織細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，且表達(dá)水平較為恒定，但其在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞新生的最重要調(diào)節(jié)因子。有研究表明，VEGF在惡性腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與腫瘤肝轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)性，同時(shí)與惡性腫瘤患者的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)。VEGF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與ERK磷酸化水平關(guān)系密切，重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可通過(guò)ERK信號(hào)通路上調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤組織中血管生長(zhǎng)[15]。在本研究中，下調(diào)Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)可促進(jìn)CNE2細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，同時(shí)下調(diào)VEGF的表達(dá)，但對(duì)JNK和p38的表達(dá)無(wú)明顯影響，而進(jìn)一步使用ERK信號(hào)通路特異性抑制劑作用后發(fā)現(xiàn)，SP600125可部分阻斷沉默Twsit對(duì)體外HUVECs小管形成的抑制作用，使用JNK和p38通路抑制劑卻沒(méi)有觀察到這種抑制作用，從而表明Twist可能調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路，影響VEGF的表達(dá)從而在體外血管新生過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。

綜上所述，Twist可通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路的激活而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞對(duì)體外內(nèi)皮細(xì)胞活力、侵襲和小管形成的作用，表明Twist可能在鼻咽癌血管新生中扮演了重要角色。Twist有望成為治療鼻咽癌新的作用靶點(diǎn)，后續(xù)會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證及探討。