京尼平抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡損傷*

師 巖， 徐 晶▲, 程 昊， 齊曉丹， 樊 麗， 梁麗杰， 寧小美， 李淑艷， 徐文雙， 陳慶友， 張春晶△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)教研室， 2附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科， 3附屬第二醫(yī)院， 4齊齊哈爾市五官醫(yī)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

糖尿病并發(fā)癥嚴(yán)重危害著人們的健康，持續(xù)高血糖導(dǎo)致的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是很多糖尿病患者發(fā)生心衰和死亡的原因之一?，F(xiàn)已明確糖尿病及其并發(fā)癥的統(tǒng)一發(fā)病機(jī)制之一是高濃度血糖水平引起人體氧化應(yīng)激損傷[1]，產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)會(huì)直接損傷心肌細(xì)胞，引起心肌細(xì)胞凋亡，常常導(dǎo)致心肌發(fā)生嚴(yán)重的功能性障礙[2]，因此通過抗氧化防治糖尿病心肌病是一個(gè)有效途徑，研究天然有效的抗氧化劑具有重要意義。

京尼平(genipin, GEN)屬于環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，是傳統(tǒng)中藥梔子花和果實(shí)中提取的京尼平苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解而生成的[3]，具有強(qiáng)抗氧化活性，小劑量應(yīng)用具有天然無毒、分子量小和易于被機(jī)體吸收等優(yōu)點(diǎn)[4]。研究顯示，京尼平對缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有很好的拮抗作用，且能夠有效減輕肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[5]，減輕氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)的癥狀[6]，具有抑制胃癌、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等細(xì)胞生長的作用[7-10]；在獨(dú)立的胰島中加入京尼平還可逆轉(zhuǎn)高葡萄糖和肥胖誘導(dǎo)的β細(xì)胞功能障礙[11]，并對血管通透性也具有一定的保護(hù)作用[12]。但是京尼平對高濃度葡萄糖引起心肌細(xì)胞損傷的作用及相關(guān)機(jī)制報(bào)道并不多見。在前期大量抗氧化劑研究的基礎(chǔ)上，我們以培養(yǎng)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞為研究對象，建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型[13]，證明京尼平在抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用及其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠心肌H9c2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)；京尼平(Cayman)；胎牛血清和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒(Invitrogen)；葡萄糖(Sigma)；0.25%胰酶-0.02% EDTA(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Thermo)；CCK-8檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；凋亡檢測試劑盒(Roche)；線粒體膜電位檢測試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、Bax和cleaved caspase-3抗體(Santa Cruz和Abcam)；抗p-Akt抗體(Cell Signaling Technology)；山羊抗鼠抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

COULTER? EPICS?XLTM流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；LSM 710激光掃描共聚焦顯微鏡(ZEISS)；酶標(biāo)儀(MD)。

2 方法

2.1大鼠心肌H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2.2實(shí)驗(yàn)分組及預(yù)處理方式 細(xì)胞分組：(1)正常糖濃度對照(normal control, NC)組：葡萄糖濃度為5.6 mmol/L；(2)高濃度葡萄糖損傷(high glucose, HG)組：葡萄糖濃度為50 mmol/L；(3)正常糖濃度葡萄糖+京尼平(NC+GEN)組：葡萄糖濃度為5.6 mmol/L,京尼平濃度為10 μmol/L；(4)高濃度葡萄糖+京尼平(HG+GEN)組：葡萄糖濃度為50 mmol/L,京尼平濃度是10 μmol/L。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將心肌 H9c2細(xì)胞以每孔2×104個(gè)的細(xì)胞數(shù)懸液接種到96孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，京尼平(10 μmol/L)作用于正常糖濃度和高葡萄糖濃度細(xì)胞中，每孔培養(yǎng)基體積100 μL，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，分組培養(yǎng)48 h，每孔加10 μL CCK-8試劑后，輕緩地晃動(dòng)培養(yǎng)板，使試劑和培養(yǎng)基充分混勻，空白對照不加細(xì)胞懸液只加110 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h后，在450 nm波長處檢測吸光度(A)值，再換算成細(xì)胞存活率比較，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.4細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性和細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性的測定 H9c2細(xì)胞用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，以(1.5～2)×108/L接種于100 mm培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后。按試劑盒說明書操作，相應(yīng)波長處測定各組細(xì)胞光密度(A)值，再換算成細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活性和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性，比較各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

2.5DCF法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平 將心肌 H9c2細(xì)胞按照每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，分組培養(yǎng)后，根據(jù)活性氧簇測定試劑盒說明書操作。采用酶標(biāo)儀于560 nm波長測定A值。

2.6ELISA檢測細(xì)胞凋亡 分組收集細(xì)胞， 4 ℃、1 500 r/min離心5 min，除上清，重新懸浮于200 μL細(xì)胞裂解液中，室溫裂解30 min，1 000 r/min離心10 min，小心吸出上清液，鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板每孔加20 μL，根據(jù)試劑盒說明書操作。采用酶標(biāo)儀于410 nm波長測定A值，每一樣品做雙孔檢測，求其平均值，并計(jì)算核小體片段聚集值。

2.7線粒體膜電位的檢測 心肌H9c2細(xì)胞用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，在JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次后，使用具有FITC和RITC通道的激光掃描共聚焦顯微鏡獲得圖像。檢測JC-1單體最大激發(fā)波長490 nm，最大發(fā)射波長530 nm；檢測JC-1聚合物最大激發(fā)波長525 nm，最大發(fā)射波長590 nm。

2.8Western blot檢測蛋白表達(dá) 將心肌H9c2細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度70%～80%， 按照分組后續(xù)實(shí)驗(yàn)，收集各組細(xì)胞獲得總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，每孔以40 μg樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE，采用濕法進(jìn)行Western blot轉(zhuǎn)膜(PVDF 膜)1 h， 5% 脫脂奶粉封閉 2 h， 加入 I 抗(Mn-SOD、p-Akt、Cyt C、Bax、cleaved caspase-3濃度為1∶500～1∶1 000，β-actin濃度為1∶5 000)，4 ℃ 孵育過夜， II 抗37 ℃ 孵育 1 h， ECL 化學(xué)顯色，Quantity One 軟件分析蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。在方差齊性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上行方差分析，并用SNK-q檢驗(yàn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 京尼平對高糖損傷的H9c2細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測不同濃度京尼平對H9c2細(xì)胞活力的影響。結(jié)合前期研究，選擇50 mmol/L葡萄糖作用于心肌 H9c2細(xì)胞72 h，作為高濃度葡萄糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷模型[13]。京尼平(10 μmol/L)作用于正常糖濃度和高葡萄糖濃度細(xì)胞，與正常糖對照組相比，高糖損傷組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；10 μmol/L京尼平作用于高糖細(xì)胞中(HG+GEN組)，相對于高糖損傷組(HG組)細(xì)胞活力顯著提高(P<0.05)；京尼平加入正常糖濃度組(NC+GEN)與正常糖對照組(NC)相比，細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1，提示10 μmol/L京尼平對高糖環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞具有抑制損傷的作用。

Figure 1.The effects of genipin (GEN) at 10 μmol/L on the viability of H9c2 cells detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHG group.

圖1CCK-8法檢測京尼平(10μmol/L)對H9c2細(xì)胞活力的影響

2 京尼平對高糖損傷的H9c2細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性及細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活性的影響

50 mmol/L葡萄糖作用48 h，與正常糖對照組比較，高糖損傷組LDH活性和MDA含量明顯增高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；但10 μmol/L濃度京尼平加入高糖中，與HG組比較，其LDH活性和MDA含量明顯下降，SOD活性顯著上升(P<0.05)，提示京尼平能有效抑制高糖引起H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，對高糖環(huán)境的細(xì)胞具有保護(hù)作用。NC+GEN組與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明京尼平對正常糖處理的細(xì)胞無影響，見表1。

表1各組細(xì)胞MDA含量及SOD和LDH活性的比較

Table 1.The changes of the MDA, SOD and LDH levels (Mean±SD.n=9)

GroupMDA (μmol/g protein)SOD (103 U/g protein)LDH (U/L)NC23.60±2.08213.651±12.893217.21±14.21HG31.80±3.14?171.148±19.596?295.96±15.32?NC+GEN24.60±2.15205.364±15.133198.66±17.89HG+GEN25.20±1.98#194.786±14.845#240.51±16.32#

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHG group.

3 京尼平對高糖誘導(dǎo)下心肌 H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

與正常糖對照組比較，高糖組ROS含量明顯增加(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+京尼平組顯著減少由高糖誘導(dǎo)損傷產(chǎn)生ROS的含量(P<0.05)；而正常糖+京尼平組與正常糖對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The effect of genipin (GEN) on ROS production in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose (HG). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHG group.

圖2京尼平對高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ROS含量的影響

4 京尼平對高糖誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡的影響

檢測心肌細(xì)胞核小體片段聚集值以評價(jià)細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果表明與正常糖對照組相比，高糖組細(xì)胞內(nèi)核小體的聚集程度明顯高于正常糖組(P<0.05)；而與高糖組相比，高濃度葡萄糖+京尼平組核小體的聚集程度顯著降低(P<0.05)，見圖3。

5 京尼平對高糖誘導(dǎo)下心肌H9c2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

激光共聚焦顯微觀察及JC-1 探針染色法檢測各組線粒體膜電位變化，結(jié)果顯示，與正常糖對照組比較，高糖損傷組的JC-1 探針綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.01)，表示線粒體膜電位下降；與高糖損傷組比較，高濃度葡萄糖+京尼平組JC-1 探針綠色熒光明顯減弱，紅色熒光強(qiáng)度增加(P<0.01)，表示線粒體膜電位升高，見圖4。

Figure 3.The effect of genipin (GEN) on the apoptosis of high glucose (HG)-induced H9c2 cardiomyocytes detected by nucleosome fragmentation enrichment factor assay. Mean±SD.n=9.**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsHG group.

圖3核小體片段聚集值分析京尼平對高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

6 京尼平對高糖誘導(dǎo)下心肌H9c2細(xì)胞Mn-SOD、p-Akt、Cyt C、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

與正常糖對照組比較，高糖損傷組細(xì)胞內(nèi)Mn-SOD 和p-Akt的蛋白水平顯著減少，Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平升高(P<0.05)； 與高糖損傷組比較，高糖+京尼平組細(xì)胞內(nèi)Mn-SOD的釋放量顯著升高(P<0.05)，Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平減少;而正常糖+京尼平組與正常糖對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

討 論

糖尿病心肌病是心肌細(xì)胞對高血糖的急性應(yīng)激反應(yīng)而表現(xiàn)出來的慢性病理改變，急性應(yīng)激反應(yīng)主要是氧化應(yīng)激反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變及細(xì)胞凋亡[14]。體外培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，模擬高糖環(huán)境中的心肌細(xì)胞相關(guān)病理變化并探討抗氧化藥物京尼平的作用機(jī)制。在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上[13, 15]，建立高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，用CCK-8法檢測的抗氧化劑京尼平對高糖損傷H9c2細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示京尼平(10 μmol/L)對正常糖培養(yǎng)的細(xì)胞存活率沒有影響，能提高高糖損傷組的細(xì)胞存活率，說明京尼平對高糖損傷的細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激系統(tǒng)平衡和抗氧化應(yīng)激酶的系統(tǒng)中MDA和SOD占據(jù)著重要的地位，MDA反映著脂質(zhì)過氧化的程度，含量過高說明受氧自由基攻擊程度較嚴(yán)重，導(dǎo)致了細(xì)胞損傷;SOD活力的大小可以直接反應(yīng)細(xì)胞清除氧自由基的能力。MDA和SOD相互驗(yàn)證細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)[16-17]。LDH是一種心肌細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志性酶，細(xì)胞損傷LDH會(huì)大量釋放出來，上清液中LDH含量升高提示著心肌細(xì)胞損傷程度，京尼平降低高糖損傷細(xì)胞的LDH，說明對細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，京尼平(10 μmol/L)能有效降低H9c2心肌細(xì)胞高糖環(huán)境產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的產(chǎn)物MDA和心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH的含量，增高細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶SOD的活力，降低活性氧簇ROS的產(chǎn)生，均證明京尼平可明顯減輕高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。蔣有琴等[18]和Hughes等[19]研究小組的京尼平抗氧化作用與本研究結(jié)果相一致。

Figure 4.The effect of genipin (GEN) on mitochondrial membrane potential in high glucose (HG)-induced H9c2 cardiomyocytes (×400). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHG group.

圖4京尼平對高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，心肌細(xì)胞要消耗大量的氧，主要通過線粒體氧化呼吸鏈，心肌細(xì)胞高糖損傷會(huì)引起線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧簇[20]，ROS的大量積累就會(huì)破壞心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的平衡，線粒體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)防御較弱，導(dǎo)致線粒體氧化損傷，加速線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放。分布在線粒體基質(zhì)內(nèi)的主要抗氧化酶Mn-SOD是一種金屬酶，對于線粒體的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的平衡具有重要保護(hù)作用，成為檢測線粒體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要標(biāo)志性酶，能有效清除生物體內(nèi)多余的氧自由基，對活性氧簇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有一定的拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)給予高糖處理的細(xì)胞給予京尼平處理，可顯著抑制ROS的產(chǎn)生，減少細(xì)胞由高糖氧化損傷引起的線粒體膜電位去極化，升高線粒體內(nèi)抗氧化應(yīng)激蛋白酶Mn-SOD的含量，均提示京尼平具有降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物生成的作用，并能維持線粒體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)酶的平衡。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件,通過JC-1熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，結(jié)果顯示，高糖損傷組比正常糖對照組線粒體膜電位下降。京尼平作用于高濃度葡萄糖時(shí)與高糖損傷組比較，JC-1 探針綠色熒光明顯減弱，紅色熒光強(qiáng)度增加，線粒體膜電位升高，說明京尼平能抑制高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。ELISA法中雙抗體夾心酶法，可以利用鈣-鎂依賴性核酸酶切割凋亡細(xì)胞的核小體，產(chǎn)生180 bp～200 bp或其倍數(shù)的核小體片段，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段的聚集程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)京尼平降低了高糖環(huán)境下核小體片段的聚集程度，進(jìn)一步說明京尼平能有效抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

高糖環(huán)境導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，線粒體功能發(fā)生一系列障礙，是細(xì)胞凋亡和壞死的重要標(biāo)志性事件[21]，Bax作為Bcl-2家族重要的促凋亡蛋白，可作為線粒體膜上離子通道的重要組成部分，Bax增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，損傷的線粒體中的Cyt C大量釋放，激活細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵核心作用的促凋亡蛋白酶 caspase-3[22]，引發(fā)線粒體凋亡通路活化，降解細(xì)胞DNA損傷修復(fù)酶，激活核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[23-24]。本實(shí)驗(yàn)檢測京尼平使高糖損傷細(xì)胞的線粒體通路級聯(lián)反應(yīng)中的促凋亡蛋白Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平下降，充分證明了一定濃度的京尼平抑制高糖細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)。

Figure 5.Western blot was used for determining the protein levels of Mn-SOD, p-Akt, Cyt C, Bax and cleaved caspase-3 in the H9c2 cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖5Westernblot檢測心肌H9c2細(xì)胞中Mn-SOD、p-Akt、CytC、Bax和cleavedcaspase-3的蛋白水平

京尼平是位于線粒體內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的特異性阻斷劑[25-27]。UCP2是一種質(zhì)子載體，在高糖信號的刺激下，可將線粒體內(nèi)膜外質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)，使線粒體膜電位去極化[28]。UCP2在線粒體電子傳遞鏈的能量代謝中發(fā)揮重要作用，必將與抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)密切相關(guān)[29-31]，我們將進(jìn)一步研究抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)與能量代謝之間的關(guān)系。

綜上所述，京尼平對于高糖損傷的心肌細(xì)胞具有抗氧化作用，其作用機(jī)制與減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的釋放，平衡抗氧化應(yīng)激酶系統(tǒng)，抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)，將為新型抗氧化劑應(yīng)用于防治糖尿病心肌病并發(fā)癥提供理論基礎(chǔ)。