豬帶絳蟲Ts14-3-3.3蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

羅 波，李 想，周必英

豬囊尾蚴病又稱豬囊蟲病(Cysticercosis)，是由豬帶絳蟲(Taeniasolium,Ts)的中絳期幼蟲——囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)感染人或豬引起的一種嚴重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康的人獸共患寄生蟲病。豬帶絳蟲成蟲寄生于人體小腸，當(dāng)孕節(jié)或蟲卵隨宿主糞便排出體外，被中間宿主人或豬吞食后，在其小腸內(nèi)孵出六鉤蚴，鉆入腸壁，經(jīng)血循環(huán)及淋巴系統(tǒng)到達腦、眼、皮下、肌肉等部位，逐漸發(fā)育為囊尾蚴引起囊蟲病，寄生于人腦引起的腦囊蟲病約占人體囊蟲病的80%以上，具有極高的致殘率與致死率[1-2]。該病呈全球性分布，國外主要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲等一些國家和地區(qū)，在我國主要以東北、華北、西北和西南等地人群發(fā)病率較高，其中貴州黔東南的凱里、從江，黔南的都勻、羅甸和黔西南的冊亨等縣(市)為少數(shù)民族聚居區(qū)，是豬帶絳蟲/囊蟲病的潛在流行區(qū)，主要與不良飲食衛(wèi)生習(xí)慣和生豬飼養(yǎng)方式不當(dāng)有關(guān)[3-5]。

國內(nèi)外學(xué)者對豬帶絳蟲生活史不同發(fā)育階段的抗原分子進行了大量研究[6-11]。其中14-3-3蛋白是一類在真核細胞內(nèi)高度保守的酸性蛋白家族，廣泛參與寄生蟲細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝、生長發(fā)育、周期調(diào)控、細胞凋亡等多種重要的生命活動[12-15]。課題組前期研究證實，豬帶絳蟲14-3-3蛋白家族共有6個編碼基因，其編碼的蛋白分別歸屬于ζ、α、ε和γ亞型[16]，我們將其依次命名為Ts14-3-3.1、Ts14-3-3.2、Ts14-3-3.3、Ts14-3-3.4、Ts14-3-3.5和Ts14-3-3.6。在其它寄生蟲也發(fā)現(xiàn)有相似的蛋白亞型，如華支睪吸蟲14-3-3ε和陰道毛滴蟲14-3-3α[17-18]，都具有較好的抗原性。本研究擬利用大腸桿菌Arctic Express原核表達重組蛋白Ts14-3-3.3，將純化后的重組蛋白免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，觀察Ts14-3-3.3蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴的分布情況，為進一步探究該蛋白的生物學(xué)功能及其作為囊蟲病免疫診斷抗原及疫苗候選抗原的潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蟲體、質(zhì)粒與菌株 豬帶絳蟲成蟲和豬囊尾蚴由遵義醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室保存，質(zhì)粒pCznⅠ、大腸桿菌Top 10和Arctic Express由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2主要試劑EasyPfuDNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠電泳材料、氨芐青霉素(Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白純化試劑盒HisLinkTMSpin Protein Purification System購自美國Promega公司；Protein A瓊脂糖純化樹脂購自生工生物工程(上海)股份有限公司；鼠源抗His單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP購自美國CST公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；弗氏佐劑購自美國Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1引物設(shè)計與合成 根據(jù)豬帶絳蟲Ts14-3-3.3基因序列(登錄號：KF752476.1)設(shè)計特異性引物，F(xiàn)：5′-GGAATTCCATATGATGGCAGCTATTA-CTTCCT-3′(含NdeⅠ酶切位點)，R：5′-GCTCTAGATTAGGAGTCAGTTTCACATTC-3′(含XbaⅠ酶切位點)。引物由滁州通用生物公司合成。

1.2.2目的基因PCR擴增 按試劑盒說明書提取豬囊尾蚴總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以豬囊尾蚴cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系50 μL：10×EasyPfuBuffer 5 μL；EasyPfuDNA Polymerase 1 μL；F、R各1 μL；cDNA模板2 μL；2.5 mmol/L dNTPs 5 μL；加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余產(chǎn)物按照凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化。

1.2.3重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3構(gòu)建與鑒定 利用NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切純化的PCR產(chǎn)物及pCznⅠ載體，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，涂布于含Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落進行PCR及酶切鑒定，最后測序驗證。

1.2.4Ts14-3-3.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化與鑒定 提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Arctic Express感受態(tài)細胞。挑取單個菌落，接種于含50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)過夜，摸索不同終濃度的IPTG(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L)、不同誘導(dǎo)時間(3 h、6 h、12 h)以及不同溫度(11 ℃、24 ℃、37 ℃)下對蛋白表達的影響，優(yōu)化出最佳誘導(dǎo)表達條件。離心收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。Ts14-3-3.3重組蛋白的純化按照HisLinkTMSpin Protein Purification System試劑盒說明書操作，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western blot)進行分析和鑒定。

1.2.5動物免疫與抗血清制備 將純化的Ts14-3-3.3重組蛋白與等體積的弗氏佐劑混勻后免疫新西蘭大白兔(皮下，400 μg/次)，共免疫3次(1次/ 2周)，末次免疫1周后頸動脈放血，收集血清，以Ts14-3-3.3重組蛋白包被酶聯(lián)板，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測免疫后兔血清抗體效價。利用Protein A親和層析膠制備親和層析柱，將Ts14-3-3.3兔抗血清按1∶1稀釋后進行柱層析純化，待抗體結(jié)合后洗脫抗體，SDS-PAGE電泳檢測其純度。

1.2.6Ts14-3-3.3天然蛋白的Western blot分析 分別提取豬帶絳蟲成蟲和豬囊尾蚴的蟲體總蛋白，采用12% SDS-PAGE進行電泳，用濕轉(zhuǎn)方法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉后進行Western blot檢測。一抗為純化后的Ts14-3-3.3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，DAB顯色后拍照，記錄結(jié)果。

1.2.7免疫組化 將豬帶絳蟲成蟲成節(jié)和囊尾蚴制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，置于檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中加熱至沸騰，重復(fù)蒸煮1～2次；滴加3% H2O2于切片上，室溫孵育10 min；以純化后的Ts14-3-3.3多克隆抗體為一抗(1∶400稀釋)，4 ℃過夜孵育；與二抗HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，DAB顯色，蘇木素-伊紅復(fù)染，每次反應(yīng)結(jié)束后需洗滌切片。梯度酒精脫水，中性樹膠封片，鏡檢。以免疫前兔陰性血清為對照，陽性反應(yīng)呈棕黃色顆粒。

2 結(jié) 果

2.1Ts14-3-3.3基因PCR擴增 以豬囊尾蚴cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，PCR擴增得到747 bp的Ts14-3-3.3目的基因片段(見圖1)，與預(yù)期大小一致。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: Ts14-3-3.3基因PCR擴增產(chǎn)物圖1 Ts14-3-3.3基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Ts14-3-3.3 gene

2.2重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3的鑒定 重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3經(jīng)NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定后，得到4 400 bp的pCznI載體片段和747 bp的Ts14-3-3.3目的基因片段(見圖2)。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3構(gòu)建成功。

M1, M2: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 酶切前質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3; 2: 酶切后質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3圖2 重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pCznⅠ-Ts14-3-3.3

2.3Ts14-3-3.3重組蛋白的表達、純化和鑒定 重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3經(jīng)11 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h后，SDS-PAGE分析，在分子質(zhì)量約29.31 kD處出現(xiàn)明顯條帶(見圖3)，其分子質(zhì)量大小與預(yù)測分子量加上His標(biāo)簽分子量的大小相符，說明該條帶為帶His標(biāo)簽的Ts14-3-3.3目的蛋白。Ts14-3-3.3重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體處理后的上清液中。將Ts14-3-3.3重組蛋白通過HisLinkTM親和層析柱純化，獲得了大小約29.31 kD的單一目的蛋白條帶(見圖4)。用Anti-His標(biāo)簽抗體作為Western blot一抗，能夠識別表達的Ts14-3-3.3重組蛋白條帶(見圖5)，說明該蛋白攜帶有His標(biāo)簽，進一步確認該條帶為Ts14-3-3.3目的蛋白條帶。

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 誘導(dǎo)前; 2: 誘導(dǎo)后; 3: 誘導(dǎo)后破碎上清；4: 誘導(dǎo)后破碎沉淀圖3 Ts14-3-3.3重組蛋白的表達Fig.3 Expression of Ts14-3-3.3 recombinant protein

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 超聲破碎后菌液; 2: 流出液; 3: 洗脫液圖4 Ts14-3-3.3重組蛋白的純化Fig.4 Purification of Ts14-3-3.3 recombinant protein

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: Ts14-3-3.3重組蛋白圖5 Ts14-3-3.3重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot identification of Ts14-3-3.3 recombinant protein

2.4免疫血清抗體效價及純度 間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)純化的Ts14-3-3.3重組蛋白免疫后兔血清抗體效價為1∶512 000(見圖6)。純化后的Ts14-3-3.3多克隆抗體通過SDS-PAGE電泳觀察，結(jié)果顯示，55 kD和25 kD處出現(xiàn)抗體重鏈與輕鏈條帶，未發(fā)現(xiàn)雜蛋白(見圖7)，提示獲得了純度較高的Ts14-3-3.3多克隆抗體。

圖6 免疫血清的抗體效價Fig.6 Antibody titer of immunized serum

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 純化后抗體圖7 純化抗體SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified antibody

2.5Ts14-3-3.3天然蛋白的Western blot分析 用制備的多克隆抗體對Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段的表達進行Western blot分析，該多克隆抗體能與豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴Ts14-3-3.3天然蛋白在分子質(zhì)量約27.75 kD處發(fā)生反應(yīng)(見圖8)，證明在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段均有Ts14-3-3.3蛋白表達，提示制備的Ts14-3-3.3多克隆抗體具有良好的特異性。

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 豬囊尾蚴; 2: 豬帶絳蟲成蟲圖8 Ts14-3-3.3天然蛋白的Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of Ts14-3-3.3 nature protein

2.6免疫組化 以Ts14-3-3.3多克隆抗體作為一抗，免疫組化分析結(jié)果顯示，該抗體能夠與豬帶絳蟲成蟲成節(jié)(見圖9 B1)和囊尾蚴(見圖9 A1)組織中的天然Ts14-3-3.3發(fā)生特異性結(jié)合，可見明顯增多的棕黃色顆粒，提示Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中均有表達。

A: 囊尾蚴; B: 成蟲; 1: 陽性血清; 2: 陰性血清圖9 Ts14-3-3.3天然蛋白的免疫組化分析(×200)Fig.9 Immunohistochemistry analysis of Ts14-3-3.3 nature protein(×200)

3 討 論

14-3-3蛋白是一類發(fā)現(xiàn)于牛腦神經(jīng)元蛋白的酸性蛋白家族，其命名來源于蛋白在DEAE-纖維素層析和凝膠電泳中的遷移位置[19]。該蛋白在物種間高度保守，廣泛參與生物體生命活動的調(diào)節(jié)，在細胞增殖、分化、衰老和凋亡過程中扮演重要角色[20-22]。研究表明，14-3-3β通過調(diào)控抑癌基因p53及其下游調(diào)控因子，能夠增強膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲能力，抑制其凋亡[23]。相反，14-3-3σ則保護細胞免受致瘤性轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)癌癥代謝重編程方面發(fā)揮重要作用[24]。在寄生蟲領(lǐng)域，14-3-3蛋白可以通過與乙酰膽堿受體(AChR)α4亞基之間的相互作用，動態(tài)調(diào)節(jié)細胞的穩(wěn)態(tài)水平，增強寄生蟲入侵宿主的能力[25]，調(diào)控寄生蟲的生長發(fā)育及形態(tài)學(xué)變化[15,26]。李宗吉等[27]利用細粒棘球絳蟲Eg14-3-3重組蛋白免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生84.47%的保護率，能有效抵抗原頭節(jié)的攻擊感染，有望成為預(yù)防棘球蚴病的候選疫苗。

多克隆抗體具有制備簡單、特異性強、耗時短、免疫學(xué)研究用途廣等優(yōu)點，利用特異性抗體對重組蛋白進行免疫定位，是檢測蛋白在寄生蟲體內(nèi)表達與功能預(yù)測的常用方法[28]。研究表明，14-3-3蛋白在寄生蠕蟲體內(nèi)的定位與其參與蟲體生理調(diào)節(jié)、生長發(fā)育以及入侵宿主密切相關(guān)[29]。Zhang等[30]利用14-3-3小鼠抗血清成功識別出日本血吸蟲蟲卵、尾蚴以及童蟲階段的14-3-3天然抗原，表明該蛋白存在于日本血吸蟲生活史的各個階段。馮琳等[31]實驗結(jié)果顯示，在15 ℃和37 ℃條件下誘導(dǎo)出的重組蛋白均以包涵體形式存在，本試驗通過降低誘導(dǎo)溫度，采用相同體系對Ts14-3-3.3蛋白進行誘導(dǎo)表達，成功獲得了豬帶絳蟲可溶性重組蛋白Ts14-3-3.3，證實了低溫條件下獲得可溶性蛋白的概率較大。將重組蛋白純化后免疫新西蘭兔，能誘導(dǎo)1∶512 000的高效價特異性血清抗體，且該抗體可以識別豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中的天然14-3-3.3蛋白，與吳冬麗等[32]結(jié)果一致，表明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。本研究結(jié)果顯示Ts14-3-3.3蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴組織中均有表達，進一步推測14-3-3蛋白可能參與豬帶絳蟲的生長發(fā)育過程，具有重要意義。就該蛋白如何參與調(diào)控豬帶絳蟲的生長發(fā)育以及致病機理，值得進一步研究。

本研究在前期獲得豬帶絳蟲14-3-3家族成員[16]的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)成功制備了可溶性Ts14-3-3.3重組蛋白并獲得了多克隆抗體，為進一步研究該蛋白的生物學(xué)功能及其在囊蟲病診斷與疫苗研究中的價值奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無