金黃色葡萄球菌VII型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展

張保海，姚學(xué)萍，王 印,2，楊澤曉，羅梓丹，項(xiàng)明源，江地科

金黃色葡萄球菌可引起動物和人類多種疾病，是人獸共患重要病原菌之一，其自身攜帶的多種毒力因子與其致病力有緊密聯(lián)系，而這些毒力因子的分泌在很大程度上則依賴于細(xì)菌分泌系統(tǒng)，在革蘭氏陽性菌蛋白分泌中發(fā)揮重要作用主要是VII型分泌系統(tǒng)。

1 Ⅶ型分泌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

革蘭氏陰性菌的蛋白分泌異常復(fù)雜，因?yàn)檫@些細(xì)菌有兩層膜結(jié)構(gòu)，這些蛋白質(zhì)必須通過這兩層膜進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境或宿主細(xì)胞。與革蘭氏陰性細(xì)菌相比，分枝桿菌在其表面存在大量羥基化支鏈脂肪酸稱為分枝菌酸，分枝菌酸共價連接到細(xì)胞壁基質(zhì)形成第2個疏水屏障，稱為分枝菌酸膜，而蛋白分泌要跨越分枝菌酸膜就需要1種特殊的蛋白分泌系統(tǒng)，最近的研究證明革蘭氏陽性細(xì)菌中存在專門的蛋白分泌系統(tǒng)，即細(xì)菌VII型分泌系統(tǒng)[1-2]。Ⅶ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅶ Secretion System，T7SS)首次在結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)，T7SS系統(tǒng)中的ESX-1系統(tǒng)分泌兩種小蛋白質(zhì)(ESAT-6和CFP-10)，現(xiàn)已分別命名為EsxA和EsxB，并且已證明它們在細(xì)菌毒力分泌方面發(fā)揮重要作用[3]。除了分泌EsxA 和EsxB蛋白之外，分枝桿菌T7SS還可以分泌更大的脯氨酸-谷氨酸蛋白(Proline-glutamicacid，PE)/脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸蛋白(Proline-proline-glutamic acid，PPE)家族蛋白，這些蛋白質(zhì)在某些物種的基因組中是大量存在的[4-5]。通過對ESX-1基因座進(jìn)行鑒定，還確定了在一個物種中存在多達(dá)5個不同位點(diǎn)的同類基因座，稱為ESX-1至ESX-5[6]。雖然在分枝桿菌中可以存在5個不同的ESX基因座，但大多數(shù)物種的ESX基因座數(shù)量較少。ESX-1和ESX-5兩個系統(tǒng)參與細(xì)菌毒力分泌，也會影響致病性分枝桿菌在細(xì)胞間遷移[2-3]。ESX-5系統(tǒng)作為分枝桿菌最活躍的分泌系統(tǒng)，它的存在可能與分枝桿菌快速增長的差異相關(guān)；ESX-3系統(tǒng)參與細(xì)菌體內(nèi)鋅、鐵平衡； ESX-5、ESX-3和ESX-1參與蛋白質(zhì)的分泌；ESX-2和ESX-4的功能目前尚不清楚[3,5]。然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌基因組中也存在與結(jié)核分枝桿菌ESX基因同源的基因簇[7-8]。金黃色葡萄球菌外毒素、表面蛋白和調(diào)節(jié)分子是重要的毒力因子，EsaB和EsaC基因在調(diào)節(jié)這些因子方面取得了很大進(jìn)展[2,5]。對于金黃色葡萄球菌中的許多毒力因子，Ess簇的調(diào)節(jié)也是比較復(fù)雜的。

2 金黃色葡萄球菌T7SS及功能

金黃色葡萄球菌基因組編碼專門的分泌系統(tǒng)ESS(ESAT-6分泌系統(tǒng))，ESS蛋白分泌系統(tǒng)促進(jìn)效應(yīng)蛋白通過細(xì)菌包膜轉(zhuǎn)運(yùn)，也是金黃色葡萄球菌建立持續(xù)性膿腫病變和血液感染期間免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)所必需的，該系統(tǒng)包括8個基因簇(esxAB、essABC、esaABC)(圖1)[9-10]。ESS編碼的esxA、esxB、esaC參與膜蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，這些基因指定了3種分泌的多肽底物[4-5]。此外，EsxA和EsxB的分泌相互關(guān)聯(lián)，EsxA的分泌依賴于EsxB的存在，這種共同依賴性與結(jié)核分枝桿菌中的ESAT-6和CFP-10極其相似，而不能分泌EsxA和EsxB的金黃色葡萄球菌突變體的毒性則顯著降低，并存在傳播和定植缺陷[8,11]。ESS基因座還包含12個編碼序列(CDs)，編碼跨膜蛋白的2個CDs(特別是essA和essB)同樣參與蛋白分泌[4-5,12]。

蛋白的分泌既有相互協(xié)同，也存在相互抑制。如EsxA和EsxB需要EssA、EssB和EssC協(xié)作轉(zhuǎn)運(yùn)通過葡萄球菌包膜分泌[13]。esaB編碼一種小的細(xì)胞質(zhì)蛋白，有抑制esaC合成的作用，但不抑制esxA和esxB的合成；esxB可與新的底物esxD和esxA結(jié)合，與其自身或esaC二聚化；esaD位于esxB的下游，其表達(dá)通過esaB和essB的突變激活，缺乏esaD的金黃色葡萄球菌突變體顯示出建立持續(xù)性膿腫病變的能力缺陷[5,14-15]。esxC是一種保守的金黃色葡萄球菌蛋白，是ESS的底物，在膿腫形成初期所發(fā)揮的作用很小，但在膿腫的長期持續(xù)中有顯著作用[9,16]。未能分泌EsxA和EsxB的金黃色葡萄球菌會導(dǎo)致膿腫感染小鼠模型的毒力降低，表明ESS途徑參與急性葡萄球菌感染的發(fā)病機(jī)制[8,12,17]。

圖1 ESS基因座結(jié)構(gòu)示意圖[9]Fig.1 Structure of ESS Locus[9]

3 T7SS分泌底物與調(diào)控

ESX系統(tǒng)中只有ESX-1、ESX-3和ESX-5參與蛋白質(zhì)的分泌，而經(jīng)由ESX-2或ESX-4為底物的主動分泌系統(tǒng)還未被證實(shí)[1,18-19]。ESX基因座是以第一個被鑒定的分泌底物命名的，即EsxA。EsxA屬于更大的蛋白質(zhì)家族WXG100蛋白。WXG100超抗原家族還包括EsxB，EsxA和EsxB可形成二聚體螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖2)，并且在厚壁菌門中EsxA作為折疊的同型二聚體；其次EsxA和EsxB對巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的復(fù)制至關(guān)重要，并且可能也與病原體抑制先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力相關(guān)[20-22]。EssC除外，另外3種膜蛋白EsaA、EssA、EssB對于T7SS分泌活性以及分泌蛋白EsxA和細(xì)胞質(zhì)蛋白EsaB是必需的[23]。通過對NCTC8325 T7SS基因簇的菌株(包括金黃色葡萄球菌Newman、USA300和RN6390)進(jìn)行的研究已經(jīng)將EsxB、EsxC和EsxD鑒定為T7SS的分泌底物，這3種蛋白很小，僅有100～130氨基酸，它們的確切功能還有待進(jìn)一步闡明[8,16-17]。

圖2 ESAT-6-CFP-10二聚體的結(jié)構(gòu)[20-22]Fig.2 Structure of the ESAT-6-CFP-10 dimer[20-22]

ESX系統(tǒng)存在5種分泌系統(tǒng)ESX-1～ESX-5，但卻彼此不互補(bǔ)，這是由于4個ESX系統(tǒng)(ESX-2～ESX-5)無法補(bǔ)充由于ESX-1缺失而導(dǎo)致的毒性減弱或喪失[5-6,8]。這對ESX-5尤其顯著，因?yàn)镋SX-5和ESX-1似乎都參與了巨噬細(xì)胞的逃逸和細(xì)胞間的擴(kuò)增。這可能意味著這2個分泌系統(tǒng)在細(xì)胞感染周期的進(jìn)程中具有獨(dú)立的作用。不同的ESX系統(tǒng)不能互補(bǔ)，這可能是由于它們的分泌信號的不同，以及它們的調(diào)節(jié)方式不同[8,18]。雖然5個ESX分泌系統(tǒng)似乎都是獨(dú)立運(yùn)作的，但也存在一定程度的交叉，ESX-3和ESX-5基因座編碼的Esx蛋白的分泌就是很好的例證[6,8,19]。最近有研究表明，由ESX-3位點(diǎn)編碼的EsxGH也形成與EsxAB具有相似結(jié)構(gòu)特征的異二聚體[20,24]。PE和PPE蛋白雖然在結(jié)構(gòu)上與ESX蛋白結(jié)構(gòu)相似，但是這兩種蛋白是由不同的ESX系統(tǒng)分泌的底物，它們也可以形成異二聚體結(jié)構(gòu)，當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時，單個蛋白表現(xiàn)不穩(wěn)定[25]。雖然已證明PE和PPE蛋白會被不同的ESX系統(tǒng)分泌，但絕大部分似乎被ESX-5分泌，這使得ESX-5系統(tǒng)成為分枝桿菌中含有許多PE/PPE基因最活躍的分泌系統(tǒng)[4,18,20]。根據(jù)對T7SS系統(tǒng)折疊二聚體結(jié)構(gòu)的觀察，由這種“單一”esx基因編碼的金黃色葡萄球菌WXG100成員之間形成同源二聚體而不是異二聚體。對于ESX-1系統(tǒng)而言，編碼分泌底物的為esp基因(EspA-EspC、 EspE、 EspJ、EspK)，除了espA和espC位于獨(dú)立操縱子之外，其他基因都位于ESX-1基因座，由于ESX-1含有多個esp基因，因此底物的變化幾乎是唯一的[26-28]。

4 T7SS對金黃色葡萄球菌毒力分泌的調(diào)控

在結(jié)核分枝桿菌毒力中起重要作用的是EsxA和EsxB[29]。同時，EsxA和EsxB也是金黃色葡萄球菌感染發(fā)病所必需的，這兩種蛋白是由ESAT-6系統(tǒng)分泌的，而ESAT-6系統(tǒng)是金黃色葡萄球菌專門的分泌途徑，其有助于血源性感染發(fā)病[30-32]。除了WXG100蛋白EsxA和EsxB，金黃色葡萄球菌的ess基因簇還含有EssABC。同時，Ess途徑也是一種交替的分泌系統(tǒng)，使人聯(lián)想到許多病原體的交替分泌系統(tǒng)，這些交替分泌系統(tǒng)將多肽轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)菌胞膜。與大多數(shù)交替分泌系統(tǒng)一樣，Ess途徑似乎只能運(yùn)輸有限的一組底物[8,22,33]。

EsaC是金黃色葡萄球菌分泌系統(tǒng)ESS分泌的底物蛋白質(zhì)，essC是ESAT-6分泌系統(tǒng)的重要組成部分，破壞essC基因可以消除esaC的分泌和在葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)中積累的蛋白質(zhì)[8,34]。利用缺少esaB的USA300和Newman菌株，將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物分離成細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和培養(yǎng)基，并用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡揭示所有組份中的蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Newman不會產(chǎn)生EsaC，然而，在缺乏esaB的USA300和Newman菌株的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了EsaC，但在細(xì)胞質(zhì)、膜和細(xì)胞壁中均沒有發(fā)現(xiàn)EsaC[8-9,14,35]。這些結(jié)果表明EsaC的產(chǎn)生受EsaB的調(diào)節(jié)。

有研究表明T7SS在小鼠感染模型中具有毒性，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌從上皮細(xì)胞釋放[4,16]。另有研究確定了金黃色葡萄球菌T7SS在細(xì)菌競爭中發(fā)揮的作用， EsaD是T7SS的一種核酸酶毒素，其分泌依賴于輔助蛋白EsaE，在其生物合成過程中EsaD的毒性活性通過與抗毒素EsaG形成復(fù)合物而被中和[5,12,20,36]。不編碼EsaD底物的金黃色葡萄球菌菌株具有esaG同源物，最有可能保護(hù)自己免受EsaD生產(chǎn)菌株的殺死，為了支持這個觀點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)過量產(chǎn)生EsaD的菌株引起對敏感菌株的顯著生長抑制[3,15,37]。此外，esaD和esaE存在共分泌，esaG僅在細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)并且可能在分泌過程中被剝離[14,36,38]。esaG的存在抵消了EsaD的毒性活性，表明esaG是一種蛋白質(zhì)抗毒素，并且通過細(xì)菌雙雜交分析證實(shí)EsaD-EsaG的相互作用，EsaG通過直接作用阻斷esaD的活性；EsaG也是EsaD穩(wěn)定性或分泌所必需的[5,39-40]。然而，EsaG不是分泌EsxA或EsxC所必需的，因此不是普通的T7SS輔助因子[16,41]。

T7SS表現(xiàn)出的這些功能可能與其一些特性存在某種聯(lián)系，這些T7SS底物存在一個特殊的性質(zhì)是當(dāng)分泌系統(tǒng)被阻斷時，一些蛋白質(zhì)通常不會積聚在細(xì)菌細(xì)胞中[5,9,29]。這種特性在不同的ESX系統(tǒng)和不同的突變中較常見，表明其可能是一種保守特性，并可以感知底物的細(xì)胞質(zhì)積聚[4,16,20]。由此可見，底物調(diào)控有一個特定的反饋機(jī)制，該機(jī)制不僅可以在轉(zhuǎn)錄起始水平上起作用，而且可能涉及RNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)翻譯起始和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。T7SS底物的另一個特性就是共依賴分泌[20]。EsxA和EsxB異二聚體的分泌取決于這兩種蛋白質(zhì)的存在，對于ESX-1分泌而言，這種依賴性似乎更加廣泛，如EspA及其伴侶蛋白EspC的分泌依賴于EsxAB的存在，反之亦然[9,20,30]。同樣的EspB的分泌取決于EspA的表達(dá)，但不依賴于EsxAB的存在[5,29-30]。然而，這種相互依賴關(guān)系未被詳細(xì)研究，我們還不清楚EspB和EspA是否以共依賴的方式分泌，并且這種現(xiàn)象背后的分子機(jī)制尚不清楚。

5 展 望

自VII型分泌系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)以來，研究者圍繞該系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)、分泌底物組成和功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制等方面進(jìn)行了大量的研究。最近的研究表明單順反子esxA轉(zhuǎn)錄物由sigma A(σA)啟動子驅(qū)動，進(jìn)而推測在Newman菌株中σB啟動子是非活性的。該分析還揭示了esxA轉(zhuǎn)錄物在sarA突變體中積累，但在agr，arlR和spoVG突變體中減少[42-43]。因此，esxA表達(dá)受已知微調(diào)分泌蛋白組的幾種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，以便協(xié)調(diào)致病性與細(xì)菌細(xì)胞密度和環(huán)境之間的關(guān)系。目前尚不清楚為什么一些Esx蛋白質(zhì)自我結(jié)合而其他蛋白質(zhì)作為異二聚體相互作用，顯然分泌物的一個特征是相互關(guān)聯(lián)，但亞基在宿主中不相互關(guān)聯(lián)。此外，結(jié)構(gòu)折疊對于廣泛中和抗體的誘導(dǎo)可能是獨(dú)特和難以控制的。在金黃色葡萄球菌中，ESS途徑是感染動物中、深部膿腫持續(xù)存在所必需的[5,9,23,44]。4種分泌的蛋白質(zhì)必須借助于這一過程，確切功能和宿主目標(biāo)仍有待確定。

金黃色葡萄球菌分泌兩種WXG100蛋白，EsxA和EsxB以及第3種多肽EsaC。通過對膿腫形成小鼠模型中的EsaB和EsaC突變體分析，揭示了金黃色葡萄球菌感染期間EsaC產(chǎn)生和分泌的作用[2,8-9]。通過觀察發(fā)現(xiàn)輔助因子EsaB可能有助于葡萄球菌感染的持久性。此外，葡萄球菌在進(jìn)入宿主組織時產(chǎn)生和分泌EsaC[45]。 EsaC的產(chǎn)生受EsaB的調(diào)節(jié)，EsaB是在Ess簇內(nèi)編碼的細(xì)胞質(zhì)保守蛋白[46]。 EsaB似乎以轉(zhuǎn)錄后的方式抑制EsaC的產(chǎn)生，缺乏EsaB的細(xì)菌會過量產(chǎn)生EsaC，而野生型細(xì)菌則不會，除非它們在宿主組織中復(fù)制[9,14]。EsaB如何介導(dǎo)抑制并感知環(huán)境信號仍然未知。盡管無法描述EsaB的生化功能，但EsaB不僅調(diào)節(jié)EsaC，還調(diào)節(jié)其他因素，這些因素有助于建立持續(xù)性感染[35,45]?？傊?，研究指出Ess基因座是金黃色葡萄球菌的新型分泌途徑，其可能干擾宿主免疫應(yīng)答并促進(jìn)細(xì)菌建立類似于結(jié)核分枝桿菌的慢性持續(xù)性感染途徑。

通過進(jìn)一步探究ESAT-6因子的免疫應(yīng)答是否可以保護(hù)宿主抵抗葡萄球菌的感染，或者缺乏ESAT-6決定簇的突變體是否可以用于減毒金黃色葡萄球菌菌株的活疫苗設(shè)計(jì)，該領(lǐng)域的工作在未來有望成為研究熱點(diǎn)。揭示EsxA/EsxB分泌機(jī)制和EssA、EssB、EssC底物的全部特性，或者可能指出預(yù)防由金黃色葡萄球菌引起的動物和人類多種疾病的新策略，特別是耐藥菌株對已知抗生素具有抗藥性以及相關(guān)抗性形成的機(jī)制。

利益沖突：無