增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變中調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展△

余進(jìn)海 劉琪 廖洪斐 徐柒華

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是眼外傷常見的并發(fā)癥。它能使視力在短期內(nèi)顯著下降，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。PVR的主要特征是通過創(chuàng)面修復(fù)過程形成視網(wǎng)膜前膜，隨著前膜的形成和收縮最終使得視網(wǎng)膜皺褶并產(chǎn)生牽引性視網(wǎng)膜脫離，從而導(dǎo)致視力下降甚至失明。手術(shù)修復(fù)是目前唯一有效的治療方式，但難以做到視網(wǎng)膜解剖學(xué)復(fù)位。較高的復(fù)發(fā)率使得學(xué)者們在積極尋找有效的藥物輔助治療途經(jīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜前膜中包含視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，其中RPE細(xì)胞被認(rèn)為是PVR病理生理過程中的主要參與者[1]。PVR中RPE細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)名為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的過程，其中涉及表型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)累積和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等多種改變。研究表明，RPE細(xì)胞的EMT過程是PVR發(fā)病的關(guān)鍵步驟[2]。本文將對近年來PVR中調(diào)控EMT的研究進(jìn)展作一綜述，以期為研發(fā)PVR的輔助治療藥物提供思路。

1 PVR中EMT的簡介

EMT是指上皮細(xì)胞在多種細(xì)胞因子、生長因子和轉(zhuǎn)錄因子的作用下轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程，在胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移和各種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用。其主要生物學(xué)表現(xiàn)為：上皮細(xì)胞中E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)減少，纖維連接蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)增加以及上皮細(xì)胞的形態(tài)、遷移和增殖等特征向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。在PVR中，視網(wǎng)膜前膜細(xì)胞分泌的各種生長因子是EMT的重要推動(dòng)者，主要包括血小板衍生生長因子、結(jié)締組織生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)等。血小板衍生生長因子和結(jié)締組織生長因子可刺激細(xì)胞增殖和遷移，而TGF-β能夠使傷口閉合、膠原收縮以及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程在PVR的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起重要作用[3]。

2 PVR中EMT所涉及的信號(hào)通路

2.1 Smad信號(hào)通路TGF-β是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種亞型結(jié)構(gòu)。它可以通過影響細(xì)胞增殖、分化和黏附來改變組織的形態(tài)。人們最初在乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TGF-β可以誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT的現(xiàn)象，隨后的研究證實(shí)，TGF-β在人體多個(gè)器官和組織的上皮細(xì)胞中均能調(diào)節(jié)EMT過程，而Smad信號(hào)通路在其中扮演了重要角色。Smads家族蛋白按功能可分為膜受體激活型、通用型以及競爭性結(jié)合受體型等多種亞型結(jié)構(gòu)。信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中，Smads家族蛋白起到了關(guān)鍵性作用，且不同的Smad蛋白可介導(dǎo)不同TGF-β家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)。Smad3是TGF-β激活素受體下游的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體,通過TGF-β信號(hào)可誘導(dǎo)產(chǎn)生血小板衍生生長因子受體，進(jìn)而能夠促進(jìn)RPE細(xì)胞的EMT過程。Saika等[4]發(fā)現(xiàn)，Smad7基因轉(zhuǎn)染人的RPE-19(acute retinal pigment epithelium-19,ARPE-19)細(xì)胞系后,可抑制其中TGF-β2/Smad信號(hào)傳導(dǎo)以及TGF-β1型膠原表達(dá)。表明Smad7基因過表達(dá)可抑制TGF-β2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞纖維化反應(yīng)。研究人員還發(fā)現(xiàn)在Smad3顯性失活的細(xì)胞中，TGF-β1不能誘導(dǎo)鳥嘌呤核苷酸交換因子的信使核糖核酸(messenger ribonucleicacid,mRNA)和蛋白質(zhì)表達(dá)[5]。提示Smad3可調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程。概括來看，在Smad蛋白介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)中，存在促進(jìn)和抑制EMT的兩種相反作用，而其中具體相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究闡明。

2.2 非Smad信號(hào)通路除了典型的Smad信號(hào)通路外，還存在多種非Smad信號(hào)通路參與了TGF-β誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象。研究人員使用鈣離子鰲合劑破壞匯合的ARPE-19細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)失去接觸抑制的細(xì)胞所產(chǎn)生的EMT伴隨著經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路激活。此外，Chen等[6]證實(shí)，用Notch受體抑制劑阻斷Notch途徑，并通過轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug來抑制Jagged-1表達(dá)可以調(diào)控TGF-β2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程。他們還發(fā)現(xiàn)除了Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/Akt,PI3K/Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路也促進(jìn)TGF-β2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中Jagged-1上調(diào)。而Jagged-1的過表達(dá)可以模擬TGF-β2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程。同樣有研究顯示，在TGF-β1誘導(dǎo)的體外RPE細(xì)胞EMT和小鼠PVR模型中，Notch信號(hào)通路也扮演著重要角色[7]。這些數(shù)據(jù)表明Jagged-1/Notch信號(hào)通路參與了TGF-β誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程，且與多條信號(hào)通路存在交叉相互作用。除此之外，Ras同源基因家族蛋白A(Ras homolog gene family member A,RhoA)[5]、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)[8]以及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)[9]等信號(hào)通路也參與了TGF-β家族成員介導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程。在信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制中，針對多條信號(hào)通路之間相互關(guān)聯(lián)的信號(hào)分子進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)，將有可能是今后研究控制PVR中EMT過程的熱點(diǎn)方向。

3 EMT的增殖作用和纖維化

3.1 EMT與增殖作用PVR的形成主要包括血-視網(wǎng)膜屏障破壞、細(xì)胞增殖以及視網(wǎng)膜前膜纖維化皺縮等幾個(gè)階段。相關(guān)細(xì)胞的增殖和遷移是其發(fā)病過程中較為重要的環(huán)節(jié)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是與胚胎期骨骼形成有關(guān)的蛋白，能夠誘導(dǎo)人體的間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨、軟骨、韌帶和肌腱等組織。有報(bào)道其特異性抑制劑能夠誘導(dǎo)心肌肥大[10]。類似地，其拮抗劑可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖作用誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞在體外發(fā)生EMT。有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中表達(dá)的BMP還具有抑制視網(wǎng)膜前膜收縮的功能[11]。這些事實(shí)證明BMP的抗增殖作用能夠延緩PVR中EMT的進(jìn)程。另一方面，Chen等[9]觀察到TGF-β1的激酶抑制劑能夠通過降低纖維連接蛋白和α-SMA的水平來抑制RPE細(xì)胞增殖和遷移，從而阻斷TGF-β1誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的EMT過程。同樣，最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的蛋白毒性應(yīng)激也可以抑制RPE細(xì)胞增殖和遷移，并起到控制EMT進(jìn)程的作用[8]。從這些研究結(jié)果來看，尋找到強(qiáng)效的抗增殖藥物也許可以逆轉(zhuǎn)RPE細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而為治療PVR提供新的途徑。但是，抗增殖藥物也容易產(chǎn)生較為明顯的不良反應(yīng)，尚需要綜合多方面因素來考慮其利弊。

3.2 EMT與纖維化PVR的病理生理過程包括成纖維細(xì)胞和肌原纖維蛋白轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生過量的ECM，并對胞外基質(zhì)施加牽引力，最終導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)扭曲和功能受損。熱休克蛋白47(heat shock protein47,HSP47)是膠原蛋白特異性分子伴侶，其表達(dá)增加有助于細(xì)胞外基質(zhì)的累積。研究表明HSP47能夠調(diào)節(jié)TGF-β2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT過程[12]。此外，He等[13]證實(shí)，從人羊膜中純化的抗瘢痕物質(zhì)能劑量依賴性的抑制ARPE-19細(xì)胞膠原凝膠收縮?？傮w來看，ECM的累積和收縮將促進(jìn)EMT過程。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)與纖維化病變有關(guān)的微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)在PVR患者的玻璃體中存在顯著改變，功能獲得的試驗(yàn)提示，玻璃體中miR-21的水平與視網(wǎng)膜纖維化疾病進(jìn)展呈正相關(guān)[14]。從這些研究來看，受損組織過度修復(fù)導(dǎo)致病變部位纖維化貫穿PVR的整個(gè)病程。尋找到有效阻止纖維化進(jìn)程的手段可能有利于控制PVR的發(fā)展。

4 EMT的能量代謝和氧化應(yīng)激

4.1 EMT與能量代謝最近，Matoba等[15]發(fā)現(xiàn)一磷酸腺苷激活的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]對RPE細(xì)胞EMT存在一定影響。作為能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，AMPK的激活劑可以抑制TGF-β2誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白下調(diào)以及纖維連接蛋白和α-SMA上調(diào)。而調(diào)節(jié)能量代謝的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體可通過其激動(dòng)劑來抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)從而調(diào)控RPE細(xì)胞的纖維化改變。這些研究顯示，能量代謝調(diào)節(jié)積極參與了RPE細(xì)胞的EMT過程。另一方面，氨基葡萄糖可通過降低TGF-β受體在RPE細(xì)胞表面水平和結(jié)合能力來抑制RPE細(xì)胞的EMT過程[16]。與之類似地，研究人員鑒定了RPE細(xì)胞EMT時(shí)細(xì)胞表面聚糖的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RPE集中與半乳糖凝集素-3發(fā)生相互作用[17]。由此看來，體外RPE細(xì)胞的EMT可能賦予了糖基化改變。此外，Huang等[18]研究顯示，糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3,GSK-3β)的抑制劑可導(dǎo)致TGF-β1介導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT，而GSK-3β過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)EMT過程。概括來說，能量代謝失衡可能是觸發(fā)PVR中EMT過程的重要因素之一，而改善能量代謝的輔助治療方式也許有助于PVR的預(yù)后。

4.2 EMT與氧化應(yīng)激研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件可以激活低氧誘導(dǎo)因子從而調(diào)控TGF-β2介導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程[19]。在此過程中低氧誘導(dǎo)因子對鈉-鉀ATP酶具有潛在的調(diào)節(jié)作用。由此可見，在RPE細(xì)胞的EMT過程中，能量代謝和氧化應(yīng)激存在一定的關(guān)聯(lián)。另外，Ko等[20]觀察到用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞在三維膠原凝膠中可以發(fā)生收縮。進(jìn)一步研究顯示，H2O2主要通過誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化來觸發(fā)EMT過程。還有報(bào)道RPE細(xì)胞中鈣超載能激活鈣蛋白酶參與H2O2氧化刺激PRE細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激改變[21]。根據(jù)這些研究，控制發(fā)生氧化應(yīng)激效應(yīng)的條件或許在一定程度上可以調(diào)控PVR中的EMT過程。

5 EMT與表觀遺傳

表觀遺傳學(xué)是指研究沒有細(xì)胞核DNA序列改變的情況時(shí)基因表達(dá)水平發(fā)生的變化。DNA甲基化、染色質(zhì)構(gòu)象改變以及非編碼RNA差異表達(dá)等均屬于表觀遺傳學(xué)的范疇。研究顯示，在PVR患者的視網(wǎng)膜中有大量甲基化CpG結(jié)合蛋白高表達(dá)[22]，提示DNA甲基化可能參與了PVR的發(fā)病過程。另一方面，組蛋白去乙?；傅囊种苿┛梢灶A(yù)防RPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和轉(zhuǎn)錄因子Snail上調(diào)。這些研究可以證明PVR中的EMT受到表觀遺傳的影響。另外，研究人員鑒定了人類miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)TGF-β2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT中有304種miRNA存在差異表達(dá)。Jun等[23]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-124可以改變RPE細(xì)胞間的擴(kuò)散和黏附能力，并以此對抗細(xì)胞膠原凝膠收縮。Li等[24]觀察到在ARPE-19細(xì)胞中抑制miR-29b可直接觸發(fā)EMT過程，其主要特征在于細(xì)胞形態(tài)改變和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)。同樣，Liu等[25]發(fā)現(xiàn)，TGF-β2在一定范圍內(nèi)以劑量和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)RPE細(xì)胞中miR-29b表達(dá)降低。有意思的是，Yang等[26]通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)實(shí)現(xiàn)長鏈非編碼RNA敲除，發(fā)現(xiàn)沉默此非編碼RNA能夠減弱RPE細(xì)胞的增殖、遷移和EMT效應(yīng)。這些研究提示，PVR的EMT過程中存在表觀遺傳的調(diào)控作用，為從基因水平防治PVR提供了一個(gè)可行的方向。

6 EMT與中藥提取物

近年來，中藥提取物在調(diào)控EMT過程的研究也相繼被報(bào)道。白藜蘆醇可以降低視網(wǎng)膜前膜中纖維化膜形成和α-SMA表達(dá)。其原理是通過激活去乙?；甘箂mad4去乙?；?，從而抑制TGF-β2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程[27]。另外，Zhou等[28]觀察到復(fù)方姜黃素在體外能夠明顯抑制RPE細(xì)胞的增殖和EMT過程，其主要是通過p53途徑激活G2期關(guān)卡來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，從而發(fā)揮抗EMT作用。與此同時(shí)，Wang等[29]發(fā)現(xiàn)藏紅花酸可以通過抑制p38的磷酸化來減少波形蛋白和α-SMA表達(dá)，從而抑制TGF-β2介導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞增殖和遷移。從這些研究來看，中藥提取物的抗EMT作用主要涉及到表觀遺傳和細(xì)胞周期的調(diào)控，但只是在PVR的模型中取得了理想效果。由于PVR的體內(nèi)和體外模型與臨床試驗(yàn)取得的結(jié)果有較大差異，使得目前仍沒有一種正式應(yīng)用于臨床治療PVR的藥物。最近，Chen等[30]發(fā)現(xiàn)白花丹素能夠顯著抑制PVR動(dòng)物模型中EMT的進(jìn)程而不引起視網(wǎng)膜不良反應(yīng)。中藥提取物的優(yōu)勢在于藥物的不良反應(yīng)可以接受，但仍需要進(jìn)行大量長期的臨床試驗(yàn)來提供驗(yàn)證和保障。