高內(nèi)涵技術(shù)檢測H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法的探討

， ，保和，

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 96孔白板、96孔黑板、20 μL槍頭、200 μL槍頭、1 mL槍頭、5 mL槍頭、加樣槽、試管架、棉球、酒精燈、移液器、50 mL離心管。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、平衡鹽溶液、雙抗(PS)、血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibcal)、過氧化氫(H2O2)、Cell Counting Kit-8(日本同仁)、Mito Tracker4?Deep Red(Invitrogen，Eugene，USA，22624)、Hoechst33342(Invitrogen，Eugene，USA，H1399)、FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Pharmingen，556547)

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 FlexStation 3(MD，美國)，高內(nèi)涵儀器(PE，美國)，Opretta system。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將提取成功且純度達(dá)90%的原代乳鼠心肌細(xì)胞接種于96孔白色培養(yǎng)板和96孔黑色培養(yǎng)板，接種細(xì)胞密度為3×104個/孔，每孔加入含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL，置于CO2孵箱正常培養(yǎng)72 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組及造模 將H2O2原液用PBS配制成10 μmol/L的母液，再用DMEM/F12 培養(yǎng)基將母液配制成不同濃度溶液并加入白色細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。濃度分組，A組：DMEM/F12(control)；B組：100 μmol/L；C組：200 μmol/L；D組：300 μmol/L；E組：400 μmol/L；F組：500 μmol/L；G組：600 μmol/L；H組：700 μmol/L；I組：800 μmol/L；J組：1 000 μmol/L；每組4個復(fù)孔，造模2 h后吸去H2O2待測。

1.4.3 細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測造模后的心肌細(xì)胞活力 按照說明書使用CCK-8試劑盒，按1∶10比例稀釋CCK-8試劑，避光，每孔100 μL加入細(xì)胞，孵箱培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測吸光度值(OD值)，計算細(xì)胞活力。

1.4.4 凋亡試劑盒檢測造模后的心肌細(xì)胞凋亡情況 使用黑色培養(yǎng)板，選取適當(dāng)?shù)腍2O2濃度對培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞進(jìn)行造模2 h后染色。熒光染料分別為：Hoechst33342(Invitrogen，Eugene，USA，H1399)，1 μg/mL；Mito Tracker?Deep Red(Invitrogen，Eugene，USA，22624)，0.1 μmol/L；FITC Annexin V(BD Pharmingen，51-65874X)，1 μg/mL；Propidium Iodide Staining Solution(BD Pharmingen，51-66211E)，1 μg/mL；用DMEM/F12配制后，分別在每孔加50 μL，在37 ℃環(huán)境下孵育20 min。PBS洗3遍，每孔150 μL，每次5 min。最后加100 μL Annexin V Binding Buffer (BD Pharmingen，51-66121E)進(jìn)行高內(nèi)涵掃描。所有操作均在避光條件下進(jìn)行。

設(shè)置合適的曝光時間和讀板高度，設(shè)定陽性細(xì)胞大小和熒光強(qiáng)度閾值，選取要讀板的孔和視野(保證各組實(shí)驗(yàn)以及重復(fù)實(shí)驗(yàn)選取的視野數(shù)目一致)，進(jìn)行掃板，得出細(xì)胞總數(shù)、死細(xì)胞數(shù)目、早期凋亡比例、晚期凋亡比例和染料熒光強(qiáng)度。

滿足廣大農(nóng)村地區(qū)讀者的閱讀需求是新聞出版公共服務(wù)體系的重點(diǎn)之一。到2017年，我國已建成農(nóng)家書屋60萬個，覆蓋了全國具備基本條件的行政村，建成數(shù)字農(nóng)家書屋3.5萬個，城鄉(xiāng)閱報欄（屏）10萬個，形成了形式多樣、內(nèi)容豐富的立體傳播體系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS分析并處理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5軟件繪制圖表并計算半數(shù)有效濃度(EC50)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞活性 不同濃度H2O2誘導(dǎo)凋亡后心肌細(xì)胞活力見圖1。使用GraphPad Prism 5軟件計算EC50為320 μmol/L，詳見圖2。選取EC50前后各一個H2O2濃度及EC50濃度使用高內(nèi)涵技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步檢測，其中EC50濃度選取配制容易且可精確配制的350 μmol/L濃度。此時選取其近似濃度300 μmol/L、350 μmol/L、400 μmol/L設(shè)定高中低劑量進(jìn)行高內(nèi)涵檢測。

2.2 心肌活細(xì)胞個數(shù) 350 μmol/L、400 μmol/L濃度的H2O2處理后心肌細(xì)胞個數(shù)均減少(P<0.05或P<0.01)，詳見圖3。

2.3 心肌細(xì)胞細(xì)胞核面積 350 μmol/L、400 μmol/L濃度的H2O2處理后心肌細(xì)胞細(xì)胞核面積均顯著縮小(P<0.01)，見圖4。

各劑量組與control組比較，*P<0.01

圖2 細(xì)胞活性曲線圖

各劑量組與control組比較，*P<0.05；#P<0.01

各劑量組與control組比較，*P<0.01

2.4 心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)損傷情況 3個濃度的H2O2均對Mito Tracker染色的細(xì)胞質(zhì)具有明顯損傷(P<0.01)。詳見圖5。

2.5 心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例 300 μmol/L濃度的H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型最理想，高內(nèi)涵篩選計算早期凋亡細(xì)胞占61.4%，晚期凋亡細(xì)胞占38.2%。3個濃度的H2O2誘導(dǎo)早期凋亡細(xì)胞比例均明顯增多(P<0.01)。詳見圖6。400 μmol/L濃度的H2O2誘導(dǎo)晚期凋亡細(xì)胞比例增多(P<0.05)。詳見圖7。

2.6 高內(nèi)涵熒光顯微成像情況 藍(lán)色染色標(biāo)記活細(xì)胞核，正常細(xì)胞核為圓形或橢圓形，熒光著色淺，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，呈弱熒光反應(yīng)；深紅色染色為標(biāo)記為線粒體的細(xì)胞質(zhì)，與正常細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞線粒體排列散亂，形態(tài)異常，熒光強(qiáng)度改變。綠色熒光強(qiáng)度可顯示早期凋亡細(xì)胞，黃色熒光強(qiáng)度可顯示晚期凋亡細(xì)胞，熒光強(qiáng)度均較對照組強(qiáng)且數(shù)量多。詳見圖8。

各劑量組與control組比較，*P<0.01

各劑量組與control組比較，*P<0.01

各劑量組與control組比較，*P<0.05

圖8 高內(nèi)涵熒光顯微成像圖片

3 討 論

3.1 H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡造模分析 CCK-8檢測結(jié)果表明200 μmol/L及以上濃度的H2O2即可抑制心肌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)其凋亡，且400 μmol/L及以上劑量可極其明顯的抑制細(xì)胞活性，但CCK-8檢測方法不能直觀細(xì)胞存活情況及損傷程度，不能計算細(xì)胞個數(shù)、凋亡百分比等量化指標(biāo)。

分析給藥后的細(xì)胞進(jìn)行染色后掃板得出數(shù)據(jù)及顯微成像圖片，Hoechst染色為藍(lán)色，Mito Tracker染色為深紅色，綠色染色為FITC標(biāo)記的膜聯(lián)素V，黃色染色為PI標(biāo)記的細(xì)胞DNA。Hoechst可穿透細(xì)胞膜標(biāo)記細(xì)胞核，顯示活細(xì)胞；Mito Tracker可標(biāo)記線粒體，線粒體是較大的細(xì)胞器，故可顯示細(xì)胞質(zhì)；膜聯(lián)素V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可與細(xì)胞發(fā)生凋亡后翻向質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合使其顯色，可指示早期凋亡和壞死細(xì)胞；PI只能標(biāo)記核破裂后溢出的DNA，可指示晚期凋亡和壞死細(xì)胞。4項(xiàng)指標(biāo)綜合分析即可判斷細(xì)胞損傷程度和計算早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞比例。分析顯示3種濃度劑量的H2O2對心肌細(xì)胞均有不同程度的損傷，均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，且隨著濃度劑量的升高，線粒體結(jié)構(gòu)改變明顯，細(xì)胞數(shù)減少，核面積減小，早期凋亡及晚期凋亡的心肌細(xì)胞均增多，檢測指標(biāo)趨勢均較為明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。300 μmol/L濃度的H2O2對原代心肌細(xì)胞損傷明顯，早期凋亡細(xì)胞占61.4%，晚期凋亡細(xì)胞占38.2%。由此可知，此劑量可造成細(xì)胞明顯的早期凋亡(P<0.01)，但尚不足以導(dǎo)致大量細(xì)胞晚期凋亡以至壞死，損傷尚可逆，故可選取300 μmol/L劑量用于誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

3.2 高內(nèi)涵檢測細(xì)胞凋亡可行性分析 本實(shí)驗(yàn)研究使用FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡試劑盒對心肌細(xì)胞染色，此試劑盒多用于免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡，應(yīng)用較為成熟，但使用高內(nèi)涵檢測方法并不多見。Annexin V是一種檢測細(xì)胞凋亡的靈敏指標(biāo)，因細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時，其由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，且此過程可早于DNA碎片發(fā)生，因此，F(xiàn)ITC標(biāo)記Annexin V結(jié)合Hoechst染色可顯示早期凋亡。PI可標(biāo)記DNA碎片，結(jié)合Hoechst染色可顯示晚期凋亡[1]。本研究使用該試劑盒加用Hoechst和Mito Tracker染料進(jìn)行染色，結(jié)果比CCK-8檢測方法對比數(shù)據(jù)更加豐富，使用高內(nèi)涵儀器進(jìn)行檢測可直觀細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞器狀態(tài)，對細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行計算，分析數(shù)據(jù)快速，準(zhǔn)確性高。非常適合高通量、多指標(biāo)檢測，且活細(xì)胞實(shí)時檢測數(shù)據(jù)更接近在體狀態(tài)，可直觀反映實(shí)時細(xì)胞情況。也有研究使用其他凋亡檢測試劑盒，對細(xì)胞染色后進(jìn)行高內(nèi)涵檢測，結(jié)果有效且可信度高[2]。

3.3 局限和展望 有研究表明高內(nèi)涵分析方法最適合于貼壁細(xì)胞的數(shù)據(jù)采集和篩選分析，尤其在高通量分析多樣本且細(xì)胞數(shù)較少時優(yōu)勢更為明顯，其可從細(xì)胞群體中的單個細(xì)胞的反應(yīng)獲取大量信息，不僅僅是一個孔板中所有細(xì)胞的平均反應(yīng)[3]?？梢栽诒３旨?xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，同時檢測細(xì)胞生長、分化、凋亡、代謝途徑等多個環(huán)節(jié)，涉及靶點(diǎn)廣泛。其分析貼壁細(xì)胞時，保留所有的形態(tài)特征和目的靶標(biāo)，用較少的細(xì)胞得到更多的數(shù)據(jù)結(jié)果，提高通量的同時節(jié)約了時間和試劑，分析速度比樣品逐個處理快達(dá)數(shù)百倍[4]。高內(nèi)涵基于圖像的分析還可以對結(jié)果進(jìn)行原始圖像的追述，如本研究中可見FITC綠色熒光標(biāo)記的Annexin V，可顯示早期凋亡細(xì)胞，在獲取信息方面更加多樣化和可視化。但高內(nèi)涵分析方法也存在一定的局限性，儀器設(shè)備購置費(fèi)用高昂，維修煩瑣，缺乏標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞凋亡等數(shù)據(jù)的處理和分析方法，染料顏色不夠豐富以致較容易重疊，可能造成實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用并不廣泛。隨著高內(nèi)涵技術(shù)的發(fā)展，或可開拓新技術(shù)，解決現(xiàn)有問題，提高利用率。

本研究為高內(nèi)涵技術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡提供了方法和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，可為今后的細(xì)胞凋亡檢測提供參考。