唾液細胞外囊泡中α-突觸核蛋白寡聚體診斷多系統(tǒng)萎縮-帕金森型的價值

曹振湯 吳瑀峰 劉亙梁 田辰 馮濤

多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy，MSA)是一種散發(fā)性、快速進展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)以自主神經(jīng)功能障礙、小腦性共濟失調(diào)、帕金森綜合征及錐體束受損為主要癥狀和體征，分為帕金森型(MSA-P)和小腦型(MSA-C)。目前MSA的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)及輔助檢查[1]，其臨床表現(xiàn)與帕金森病(PD)相似，兩者鑒別存在一定困難。CIT-SPECT[2]、頭MRI[3]、心臟123I-間碘芐胍攝取顯像[4]等輔助檢查有益于MSA和PD的鑒別，但其敏感性和特異性較低，對設備及技術要求高且價格昂貴；肛門括約肌肌電圖等電生理檢查對其診斷的意義尚存在爭議。因此，尋找MSA生物學標記物對于MSA的診斷及鑒別診斷具有重要意義。

MSA神經(jīng)病理特征主要是少突膠質(zhì)細胞胞質(zhì)包涵體(glial cytoplasmic inclusions，GCIs)的形成，α-突觸核蛋白是GCIs的主要成分，是一種小分子胞內(nèi)蛋白，由140個氨基酸組成。既往關于MSA生物學標記物的研究集中于腦脊液(CSF)和血液樣本，且研究結果尚不一致。有研究結果顯示，MSA患者CSF/血漿中α-突觸核蛋白總量低于健康對照組[5-11]，亦有研究結果顯示MSA患者CSF/血漿中[5，12-15]α-突觸核蛋白總量與對照組比較無統(tǒng)計學差異。此外，CSF和血液樣本的獲取存在一定局限性，如CSF收集為有創(chuàng)操作，不易獲得，易混雜血液而影響檢測結果；血液樣本處理過程中易發(fā)生溶血現(xiàn)象，且血小板亦會影響檢測結果。近年來，唾液成為PD生物學標記物研究的理想體液，與CSF和血液樣本相比，唾液具有易獲得、易普及、不易受血液污染的特點。PD和MSA均屬于突觸核蛋白病，目前尚未檢索到有關MSA患者唾液中α-突觸核蛋白的研究。外泌體是細胞外囊泡的一種，研究結果示，外泌體以一種類似朊病毒的方式將大腦毒性α-突觸核蛋白轉運至體液中，導致PD相關癥狀的發(fā)生[16]，推測MSA患者體內(nèi)α-突觸核蛋白的轉運可能與PD類似，與外泌體有關[17]。寡聚體形式的α-突觸核蛋白具有神經(jīng)毒性[18]，更能反映疾病的病理狀態(tài)。本研究對MSA-P患者唾液中是否存在外泌體，以及唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體在MSA-P診斷中的作用進行探討。

1 對象和方法

1.1研究對象收集2016-11-01—2017-12-31就診于首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)變性病科的MSA-P患者16例，其中男9例，女7例，年齡48～76歲，平均(57.3±7.8)歲。另招募就診患者的親屬為健康對照組，共60名，其中男26名，女34名，年齡40～78歲，平均(58.8±9.9)歲。入選標準：(1)MSA-P患者符合2008年發(fā)表的第2版MSA診斷專家共識[19]；(2)對照組不存在運動障礙疾病，無神經(jīng)系統(tǒng)疾病史，無自身免疫性疾??；(3)簽署知情同意書。排除標準：(1)嚴重焦慮、抑郁和精神分裂癥；(2)合并心、肺、肝、腎、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、口腔、血液系統(tǒng)嚴重疾??；(3)依從性較差者。兩組間性別構成和年齡比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。

1.2主要試劑和儀器包括CD63抗體(BD，USA)，IgG抗體、ProteinA/G PLUS-Agarose、CD9抗體(Santa，USA)，XYCQ EV Enrichment Kit(新源長青生物科技有限公司)，分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、BCA試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)，Alix抗體(Merk&Millipore，USA)，α-突觸核蛋白寡聚體蛋白(Proteos，USA)，標記生物素的捕獲抗體、結合磺基修飾標簽的檢測抗體、稀釋液35、石墨電極檢測板(MSD，USA)，低溫超速離心機(貝克曼Avanti J-26xp，USA)，增強型ECL化學發(fā)光液(北京康碧泉生物科技有限公司)，Western blotting電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，Nanosight300(Nanosight，UK)。

1.3方法

1.3.1資料收集：收集入組對象姓名、性別、年齡、既往史、個人史，以及MSA-P患者文化程度、起病年齡、病程、家族史。

1.3.2唾液樣本收集：早上9：00～11：00收集，囑受試者安靜休息10 min，禁止活動或說話，溫水漱口5 min清潔口腔環(huán)境，口腔微張、頭低位，收集自然分泌出的唾液至少5 mL，采用低溫超速離心機4℃下以2600g離心15 min，離心后的上清液再次置4℃以下15 000g離心15 min，分裝于1 mL預冷EP管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3外泌體的免疫純化：將1 mL唾液樣本加入5 μg IgG抗體和100 μL ProteinA/G PLUS-Agarose，4℃孵育30 min，4℃下以12 000g離心5 min，收集上清，采用XYCQ EV Enrichment Kit富集出全部細胞外囊泡，磷酸緩沖液(PBS)重懸細胞外囊泡，加CD63抗體，4℃孵育2 h，再加100 μL ProteinA/G PLUS-Agarose，置于4℃冷室環(huán)境360度旋轉混勻儀上，孵育過夜，4℃下12 000g離心5 min棄上清，PBS洗滌沉淀4次，棄上清，加40 μL 蛋白上樣緩沖液，4℃下12 000g離心10 min收集上清。

1.3.4外泌體的驗證：運用Western blot 驗證唾液細胞外囊泡是否存在外泌體的通用標記物——Alix和CD9的表達。配制10%(質(zhì)量濃度)分離膠，灌膠后三蒸水封膠30～40 min，待分離膠完全凝固有明確界面后灌注濃縮膠；配制電泳緩沖液，將膠板安裝于電泳槽，加滿電泳緩沖液，將預染蛋白與處理好的樣本依次緩慢加入膠孔底部，接通電源；取合適大小的PVDF膜，甲醇活化5 min配制轉膜緩沖液，取出膠板，切去濃縮膠，制作三明治夾，將其放入轉膜槽，接通電源，轉膜2 h；室溫封閉已經(jīng)轉有蛋白的PVDF膜1 h；分別進行一抗和二抗雜交后，將增強型ECL化學發(fā)光液均勻滴在PVDF膜上后，送入顯影儀顯影。采用Nanosight 300納米顆粒跟蹤分析儀進行唾液細胞外囊泡粒度分析：設定運行腳本，視頻重復3次，視頻時間60 s，視頻間隔1 s。

1.3.5寡聚體α-突觸核蛋白檢測：應用BCA試劑盒測定唾液外囊泡內(nèi)總蛋白含量。配制標準液，樣本液配制，562 nm波長下測定吸光度值，繪制標準曲線，計算樣本總蛋白濃度。通過標記生物素制備捕獲抗體，結合磺基修飾標簽(SULFO-TAG)制備檢測抗體。將寡聚體α-突觸核蛋白以稀釋液35稀釋，4倍倍比稀釋6次，將50 μL 稀釋后的生物素標記的捕獲抗體加入電化學發(fā)光免疫檢測儀石墨電極檢測反應板的檢測孔中，封膜；以3360g離心并反應2 h，棄液，加緩沖液清洗3次，拍板；加入稀釋液35后，用封板膜封嚴檢測反應板；以3360g離心并反應1 h，棄液，加緩沖液清洗3次，制備待測樣品及標準品；稀釋已經(jīng)結合SULFO-TAG的檢測抗體，封膜；以3360g離心并反應1 h，棄液，加緩沖液清洗3次，加入讀板工作液；采用檢測儀器讀取石墨電極檢測反應板中數(shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 24.0和Prism 7.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；ROC曲線分析唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體作為診斷疾病的敏感性和特異性，并尋找最佳臨界值；采用Spearman相關性分析分析唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體水平和臨床特征的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1唾液細胞外囊泡所有試劑盒富集的沉淀中均可以檢測到外泌體的通用標記物——Alix和CD9表達，外囊泡主要為30～400 nm大小，其中119 nm大小的囊泡濃度最高。

2.2唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體水平MSA-P組唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體含量高于健康對照組〔(19.32±8.13)pg/ng比(1.37±0.24)pg/ng；t=3.786，P<0.01〕。

2.3ROC曲線分析應用唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體作為標記物診斷MSA-P，ROC曲線下面積為0.947(P<0.01)，最佳臨界值為2.085 pg/ng，其診斷MSA-P的敏感性為93%，特異性為86%(圖1)。

注：MSA-P：多系統(tǒng)萎縮-帕金森型 圖1 唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體診斷MSA-P的ROC曲線分析

2.4相關性分析MSA-P組病程1～6年，平均為(3.06±1.73)年，起病年齡44～71歲，平均為(54.25±7.68)歲。MSA-P組唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體水平與年齡(r=0.267，P=0.336)、起病年齡(r=-0.098，P=0.727)、病程(r=0.215，P=0.441)無相關性。對照組唾液細胞外囊泡α-突觸核蛋白寡聚體含量與年齡無相關性(r=0.137，P=0.381)。

3 討論

α-突觸核蛋白是由SNCA基因編碼的相對分子質(zhì)量為18 000～20 000的蛋白質(zhì)，是路易小體(Lewy bodies，LBs)的主要成分。LBs是路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)和PD的典型病理表現(xiàn)。除此之外，α-突觸核蛋白也可沉積于MSA患者的少突膠質(zhì)細胞內(nèi)形成包涵體。DLB、PD、MSA均屬于α-突觸核蛋白病[20]。早期研究認為α-突觸核蛋白僅存在于細胞內(nèi)，而目前研究顯示CSF[12]、血漿[10]、唾液[21]等細胞外體液中均可發(fā)現(xiàn)α-突觸核蛋白，其可能通過外泌體進行分泌傳播[22]。對于突觸核蛋白病，α-突觸核蛋白是其潛在的生物標記物。該研究對MSA患者唾液中α-突觸核蛋白的診斷價值進行了探討。

外泌體是細胞外囊泡中的一種。細胞外囊泡是細胞旁分泌產(chǎn)生的一種亞細胞成分，包含從細胞釋放出來的多種限制性囊泡，根據(jù)囊泡的來源或者大小，分為3類：凋亡小體、微囊泡和外泌體[23]。凋亡小體體積最大，大小為1000～5000 nm，微囊泡大小為100～1000 nm，外泌體體積最小，大小約30～100 nm[24]。該研究結果顯示，MSA-P患者唾液細胞外囊泡存在外泌體的通用標記物——Alix和CD9的表達，經(jīng)Nanosight300粒度分析發(fā)現(xiàn)110 nm的唾液細胞外囊泡濃度最高，符合外泌體直徑標準，表明MSA-P患者唾液細胞外囊泡中外泌體的存在。該研究結果支持既往推測[17]：MSA可能與PD存在相似的病理機制，外泌體以類似朊病毒的方式分泌傳播α-突觸核蛋白，導致相應部位α-突觸核蛋白沉積產(chǎn)生相應的臨床癥狀。外泌體可加速外源性α-突觸核蛋白的聚集[25]，導致α-突觸核蛋白的寡聚化[26]。

寡聚體形式的α-突觸核蛋白具有神經(jīng)毒性[18]。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)MSA患者紅細胞中α-突觸核蛋白寡聚體水平高于對照組。外泌體中α-突觸核蛋白有望成為突觸核蛋白病的診斷標記物[16]。本研究結果顯示，MSA-P患者唾液細胞外囊泡中α-突觸核蛋白寡聚體水平高于健康對照組，運用ROC曲線分析顯示其在診斷MSA-P中具有較高的敏感性(93%)和特異性(86%)，提示其有望成為MSA-P患者診斷的外周生物學標記物。關于α-突觸核蛋白寡聚體較對照組升高的原因尚不清楚，研究顯示外泌體可促進α-突觸核蛋白的寡聚體化[26]，MSA-P患者唾液細胞外囊泡中存在外泌體，這可能是導致其α-突觸核蛋白較對照組升高的原因，但具體機制有待進一步深入研究。

本研究結果顯示MSA-P患者唾液細胞外囊泡中α-突觸核蛋白寡聚體與年齡、起病年齡、病程均無相關性。既往研究結果亦顯示MSA患者血漿α-突觸核蛋白水平與疾病進展之間無相關性，其原因可能為：其一，α-突觸核蛋白寡聚體具有分子異質(zhì)性；其二，本研究樣本量小，導致未發(fā)現(xiàn)相關性[11]。近年來，Shi等研究發(fā)現(xiàn)PD患者血漿外泌體中α-突觸核蛋白與疾病嚴重程度存在相關性[16]，外泌體可通過血-腦脊液屏障[28]，且易從唾液等生物體液中提取[29]，被認為是神經(jīng)變性疾病有希望的潛在標記物。

綜上所述，本研究結果顯示，MSA-P患者唾液細胞外囊泡中存在外泌體，唾液細胞外囊泡中α-突觸核蛋白寡聚體高于健康對照組，其在診斷MSA-P中具有較高的敏感性和特異性，有望成為MSA-P的外周生物學標記物。未來，作者所在團隊將進一步從MSA患者唾液細胞外囊泡中提取外泌體，鑒定其來源，檢測其中是否存在α-突觸核蛋白及其含量，若發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的外泌體存在，則更有助于MSA發(fā)病機制、診斷、鑒別診斷的研究。此外，通過設立PD對照組，進一步分析PD患者和MSA患者唾液細胞外囊泡外泌體α-突觸核蛋白寡聚體的差異，對于兩者的鑒別具有重大意義。