左乙拉西坦對(duì)癲癇患者主穹窿蛋白水平及認(rèn)知功能的影響

張麗霞 王一晶

癲癇是一種慢性腦功能障礙疾病，主要發(fā)病原因?yàn)榇竽X皮質(zhì)神經(jīng)元異常放電，其發(fā)病不僅對(duì)患者造成身體危害，還會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙和心理功能障礙[1-2]。癲癇具有癲癇發(fā)作易感性的臨床特征，如經(jīng)臨床治療或多次治療仍未達(dá)到理想效果，則提示可能存在耐藥性的發(fā)生[3]。研究結(jié)果表明，在兒童癲癇患者中，因產(chǎn)生耐藥性而經(jīng)正規(guī)治療無(wú)效者占20%～30%[4]。主穹窿蛋白(major vault protein，MVP)是癲癇耐藥性機(jī)制研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，MVP可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換和囊泡運(yùn)輸參與多藥耐藥的機(jī)制[5]，癲癇患者病變部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元以及腦組織中發(fā)現(xiàn)有MVP大量表達(dá)[6-7]。本研究通過(guò)檢測(cè)左乙拉西坦治療癲癇患者外周血MVP表達(dá)水平及認(rèn)知功能的變化，旨在探討左乙拉西坦改善患者認(rèn)知功能的可能機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象收集2013年1月至2016年1月作者醫(yī)院收治的經(jīng)口服左乙拉西坦治療的癲癇患者120例，其中男77例、女43例，年齡7～63歲、平均(35.1±6.1)歲；病程為2～10年、平均(6.7±3.1)年。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡4歲以上；經(jīng)臨床及腦電圖檢查確診為癲癇[8]；入組前3個(gè)月內(nèi)癲癇發(fā)作在2次以上并未接受抗癲癇藥物治療；患者未合并其他嚴(yán)重系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及其他影響本研究觀察指標(biāo)的疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神病史者、情緒極端者及其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)認(rèn)知功能異常者、依從性較差者、無(wú)法完成研究者或中途脫落者。所有患者及家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1治療方案：給予患者口服左乙拉西坦口服溶液〔藥品名：開浦蘭，購(gòu)自優(yōu)時(shí)比(珠海)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20160153，規(guī)格：10%(150 mL∶15 g)〕，以適量水吞服，服藥不受進(jìn)食影響。按體重及年齡用藥：(1)針對(duì)體重50 kg以上且年齡在12歲以上的兒童及成人，起始治療劑量為500 mg，2次/d，根據(jù)治療效果和耐受性，可按照2～4周調(diào)節(jié)最高劑量為1500 mg/次，2次/d；(2)針對(duì)11歲以下兒童及體重在50 kg以下的12歲以上兒童，起始治療劑量按體重10 mg/kg，2次/d，根據(jù)治療效果及耐受性，每2周按體重10 mg/kg增加或減少，調(diào)整最高劑量為30 mg/kg；(3)兒童和體重≥50 kg的青少年，其劑量和成人一致；(4)對(duì)于年齡在65歲以上者，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)用藥劑量。治療時(shí)間為12個(gè)月，治療期間監(jiān)測(cè)患者的肝功能、血常規(guī)和電解質(zhì)等，若患者出現(xiàn)嚴(yán)重不適癥狀應(yīng)當(dāng)及時(shí)停止用藥。

1.2.2外周血MVP基因檢測(cè)：采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。分別于用藥前、用藥6個(gè)月和用藥12個(gè)月時(shí)，于清晨抽取空腹外周血2 mL，分離細(xì)胞，應(yīng)用Trizol試劑并按照說(shuō)明書提取RNA。引物序列為：MVP基因：上游序列為5′-AGCTCAGCGGTACTTC-3′、下游序列為5′-GCCCGCGGGTCTCGAAC-3′；β-actin：上游序列為5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGG-3′，下游序列為5′-GACTCATCGTACTCCT-GCTTGC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分析，并采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm、280 nm處吸光度〔D(λ)〕值。按下列公式計(jì)算RNA純度：RNA純度=D(λ)260 nm/D(λ)280 nm，數(shù)值范圍在1.7～2.0有效；按下列公式計(jì)算RNA濃度：RNA濃度(μg/μL)=4×D(λ)260 nm。

1.2.3外周血MVP蛋白檢測(cè)：采用Western-blot法進(jìn)行檢測(cè)。分別于用藥前、用藥6個(gè)月和用藥12個(gè)月時(shí)，于清晨抽取空腹外周血2 mL，使用RIPA裂解液提取包膜蛋白，制備7%(質(zhì)量濃度)SDS-PAGE凝膠，加樣電泳，待溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，將硝酸纖維素膜浸入含1 g脫奶粉的20 mL緩沖液封閉液中，置水平搖床上，溫室封閉2 h，然后用緩沖液清洗3次，每次5 min；用封閉液配置一抗孵育，4℃過(guò)夜。第2天復(fù)溫30 min，用緩沖液清洗3次，每次5 min；放入用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗IgG，室溫2 h。緩沖液清洗3次，雙蒸水清洗1次，化學(xué)顯色后將光片采用Bio-Rad2000型凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應(yīng)用Quantity One軟件分析其灰度值，計(jì)算MVP蛋白條帶與β-actin灰度值的比值表示MVP蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4認(rèn)知功能檢測(cè)：于用藥前、用藥6個(gè)月和用藥12個(gè)月應(yīng)用韋氏智力量表對(duì)患者的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)分，包括總智商、語(yǔ)言智商以及操作智商等，短時(shí)記憶采用短時(shí)視覺記憶進(jìn)行評(píng)分。檢測(cè)時(shí)應(yīng)保證每組所處的時(shí)間、空間和外部環(huán)境一致。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差示，多組均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

120例患者均完成各指標(biāo)觀察和檢測(cè)，無(wú)脫落、中止和死亡病例。

2.1患者外周血MVPmRNA和MVP蛋白表達(dá)比較用藥6個(gè)月和用藥12個(gè)月時(shí)外周血MVP mRNA表達(dá)水平和MVP蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較用藥前降低(均P<0.05)，且用藥12個(gè)月時(shí)外周血MVP mRNA表達(dá)水平和MVP蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于用藥6個(gè)月時(shí)(均P<0.05)。結(jié)果見表1、圖1。

表1 癲癇患者用藥不同時(shí)間外周血MVP mRNA和MVP蛋白表達(dá)比較

注：MVP：主穹窿蛋白，圖1同；與用藥前比較，aP<0.05；與用藥6個(gè)月比較，bP<0.05

圖1 癲癇患者治療不同時(shí)間外周血MVP蛋白表達(dá)(Western blot)

2.2各組患者認(rèn)知功能評(píng)分用藥12個(gè)月后，患者總智商、語(yǔ)言智商、操作智商及短時(shí)視覺記憶評(píng)分較用藥前和用藥6個(gè)月后均有改善(均P<0.05)，而用藥6個(gè)月上述評(píng)分與用藥前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組癲癇患者認(rèn)知功能評(píng)分比較

注：與用藥前和用藥6個(gè)月分別比較，aP<0.05

2.3不良反應(yīng)患者治療期間出現(xiàn)情緒激動(dòng)5例、嗜睡3例、心悸2例、頭暈3例、惡心2例，上述不良反應(yīng)均在患者的耐受及可控范圍內(nèi)，未給予特殊處理。

3 討論

MVP是目前發(fā)現(xiàn)的與癲癇聯(lián)系密切的耐藥基因之一，首次發(fā)現(xiàn)于大鼠肝組織標(biāo)本中。MVP不僅參與正常生理功能過(guò)程，還參與多種病理狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤、癲癇和血液病等[9]。MVP作為一種胞質(zhì)蛋白顆粒，能與進(jìn)入胞質(zhì)中的藥物形成囊泡，并通過(guò)胞吐作用排出細(xì)胞，導(dǎo)致靶點(diǎn)藥物有效濃度降低而產(chǎn)生耐藥[10]；此外，MVP還可能通過(guò)改變藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布，使藥物呈房室性分布，在胞內(nèi)隔離藥物，導(dǎo)致藥物與細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)隔離而產(chǎn)生耐藥[11]。有學(xué)者在38例難治性癲癇患者手術(shù)切除的額葉致癇灶皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了MVP的陽(yáng)性表達(dá)[12]，亦有研究在癲癇患者腦組織中發(fā)現(xiàn)MVP大量表達(dá)，其被認(rèn)為是導(dǎo)致抗癲癇藥物治療失敗的一個(gè)因素，推測(cè)MVP可能參與癲癇耐藥的形成[13]。

左乙拉西坦屬于吡咯烷酮衍生物，短期通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)水平調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性，長(zhǎng)期療效則通過(guò)特異性結(jié)合突觸囊泡蛋白SV2A，降低神經(jīng)遞質(zhì)釋放，并阻止癲癇發(fā)作。在局限性和全面性癲癇發(fā)作的動(dòng)物模型中，左乙拉西坦具有神經(jīng)保護(hù)作用，并開始用于兒童癲癇的治療[14-15]。研究結(jié)果顯示，左乙拉西坦在控制青少年癲癇發(fā)作的同時(shí)，可部分改善患者的認(rèn)知功能[16]。本研究結(jié)果顯示，癲癇患者經(jīng)左乙拉西坦治療12個(gè)月后，患者總智商、語(yǔ)言智商、操作智商及短時(shí)視覺記憶評(píng)分較用藥前和用藥6個(gè)月后均有顯著改善，且用藥期間未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，提示長(zhǎng)期服用左乙拉西坦能有效改善癲癇患者的認(rèn)知功能，且安全性較高，可能利于癲癇的病情控制。

生理狀態(tài)下，MVP基因及MVP蛋白存在微量表達(dá)，是組織器官正常生理代謝產(chǎn)物。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)左乙拉西坦治療后患者外周血MVP mRNA及其蛋白表達(dá)量均較用藥前降低，且用藥12個(gè)月后MVP mRNA和MVP蛋白表達(dá)量低于用藥6個(gè)月，表明左乙拉西坦并非MVP底物，但能降低MVP的表達(dá)而改善癲癇認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，應(yīng)用左乙拉西坦能有效改善癲癇患者認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能與下調(diào)MVP的表達(dá)有關(guān)。由于本研究未對(duì)用藥人群的年齡、用藥劑量以及體重等進(jìn)行多因素的校正，因此左乙拉西坦對(duì)癲癇患者認(rèn)知功能的確切療效及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。