不同試劑盒提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素水平的比較

李衛(wèi)玲，易初麗

（江漢大學(xué) 武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056）

質(zhì)粒是細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中一種染色體外雙鏈閉環(huán)的DNA分子，以超螺旋狀態(tài)存在，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力。質(zhì)?？蓪⒂杏玫耐庠椿蛲ㄟ^基因工程的手段送入細(xì)菌中進(jìn)行繁殖和表達(dá)，是分子生物學(xué)試驗(yàn)中常用的工具[1]。

內(nèi)毒素為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要組成成分脂多糖，是誘發(fā)炎癥反應(yīng)過程中主要的致病成分[2]。鱟試劑法作為一種檢測(cè)疫苗制品細(xì)菌內(nèi)毒素的方法已被列入《中華人民共和國(guó)藥典》[3]。

由于研究目的不同，對(duì)質(zhì)粒DNA質(zhì)量的要求也不同，質(zhì)粒DNA提取試劑盒的選擇成為試驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵，但對(duì)質(zhì)粒內(nèi)毒素水平檢測(cè)的研究較少。本試驗(yàn)嘗試采用鱟試劑顯色基質(zhì)法測(cè)定6種不同市售試劑盒提取質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素水平，為質(zhì)粒DNA提取方案的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pCMV-EGFP購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 試劑

6種試劑盒分別為：1）QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒 Plasmid Mini Kit（12123）；2）QIAGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit（12362）；3）康為世紀(jì)高純質(zhì)粒中提試劑盒（CW0502）；4）A廠家無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒；5）B廠家無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒；6）C廠家無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒。6種試劑盒均購(gòu)自荊楚恒盛生物科技有限公司。鱟試劑（批號(hào)170412，λ=0.125 EU/mL，規(guī)格0.1 mL）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)160903，規(guī)格2 mL）、細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)照品（批號(hào)170414，規(guī)格15EU）、顯色基質(zhì)鱟試劑盒（含偶氮化試劑，批號(hào)170416）購(gòu)自廈門鱟試劑生物科技有限公司。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫氣浴搖床購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Eppendorf公司；生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 質(zhì)粒DNA的提取 準(zhǔn)備攜帶pCMV-EGFP質(zhì)粒菌液，應(yīng)用6種試劑盒提取質(zhì)粒DNA，每組重復(fù)3管，具體試驗(yàn)操作參照試劑盒說明書。提取質(zhì)粒DNA后，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度（μg/mL）、A260/A280及A260/A230值，用于評(píng)價(jià)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。

1.4.2 鱟試劑靈敏度的復(fù)核 參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[3]中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)法。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.030 0 EU/mL的內(nèi)毒素對(duì)照溶液，分別吸取0.1 mL上述溶液，加入待復(fù)核的鱟試劑中，每個(gè)濃度平行做3管。同時(shí)取待復(fù)核的鱟試劑，加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，作為陰性對(duì)照。輕柔混勻，封口膜封住管口，垂直放入37℃溫箱孵育40 min。觀察凝結(jié)情況，并按公式λc=lg-1(∑X/4 )計(jì)算鱟試劑實(shí)際靈敏度λc。λc在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，表示該鱟試劑可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按顯色基質(zhì)法試劑盒說明書，配好檢測(cè)試劑和不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。取4支試管，加100 μL的鱟試劑溶液。分別取100 μL濃度為1.00、0.50、0.25、0.10 EU/mL內(nèi)毒素溶液加入試管中，每組重復(fù)3管，同時(shí)以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作空白對(duì)照管。輕柔混勻，于37℃溫箱孵育8 min。加入顯色基質(zhì)液100 μL，混勻，再置37℃溫箱孵育6 min。各管均加入0.5 mL偶氮化溶液1號(hào)，混勻后繼續(xù)加入偶氮化溶液2號(hào)0.5 mL，混勻后再次加入偶氮化溶液3號(hào)0.5 mL，混勻，室溫靜置5 min，測(cè)定545 nm處的吸光度。將內(nèi)毒素濃度（C）對(duì)吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.980時(shí)，試驗(yàn)有效。

1.4.4 質(zhì)粒內(nèi)毒素水平測(cè)定 通過凝膠法半定量測(cè)定質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素水平。首先將質(zhì)粒DNA進(jìn)行稀釋，每組重復(fù)3管，向鱟試劑中加入0.1 mL的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水混勻，并加入等體積的質(zhì)粒樣品，取2管加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。輕輕混勻，37℃溫箱中保溫40 min。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到震動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

根據(jù)鱟試劑顯色基質(zhì)法說明書檢測(cè)適度稀釋后質(zhì)粒樣品中內(nèi)毒素水平（EU/μg），每組重復(fù)3管，顯色后測(cè)定產(chǎn)物在545 nm處的吸光度值，依據(jù)回歸方程計(jì)算內(nèi)毒素水平。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS Statistics17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種試劑盒提取質(zhì)粒DNA

上述6種試劑盒的操作步驟均較為簡(jiǎn)單方便，分別取質(zhì)粒樣品10 μL，用洗脫液作為空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)測(cè)定，記錄質(zhì)粒DNA相關(guān)數(shù)值。測(cè)定結(jié)果表明，各試劑盒提取質(zhì)粒的得率和純度均符合相應(yīng)說明書要求，可用于后續(xù)內(nèi)毒素水平測(cè)定（見表1）。

表1 6種試劑盒提取質(zhì)粒DNA測(cè)定結(jié)果Tab.1 Comparisons of extraction effects of plasmid DNA with six kits

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，制成2.00、1.00、0.50、0.25λ的溶液，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[3]，以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對(duì)照管，對(duì)鱟試劑進(jìn)行λ復(fù)核。結(jié)果顯示，λc=0.05 EU/mL在0.50～2.00λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定（見表2）。

表2 鱟試劑的λ復(fù)核結(jié)果Tab.2 Recheck results ofλforLimulusamebocyte lysate

將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別調(diào)整為0.10、0.25、0.50、1.00 EU/mL，按照說明書操作，測(cè)定4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度在545 nm處吸光度值，結(jié)果見表3。將內(nèi)毒素濃度（C）對(duì)吸光度值（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=1.16C-0.11，R2=0.980。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線符合試劑盒要求，可用于后續(xù)結(jié)果計(jì)算。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab.3 Data of standard curve

2.3 6種試劑盒提取質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素水平

分別采用凝膠法和顯色基質(zhì)法檢測(cè)6種試劑盒所提質(zhì)粒中內(nèi)毒素水平。首先取質(zhì)粒樣品，分別稀釋后用于檢測(cè)，記錄凝膠形成情況；再選取適度的稀釋倍數(shù)用顯色基質(zhì)法測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算內(nèi)毒素水平，結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明，上述兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致。其中，QIAGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒的內(nèi)毒素殘留最低，小于0.125 EU/μg；A、B、C廠家無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒的內(nèi)毒素水平較低；QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒的內(nèi)毒素水平仍較高；內(nèi)毒素水平最高的是康為世紀(jì)高純質(zhì)粒中提試劑盒。6種試劑盒中標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素的系列提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素殘留均較低，并且QIAGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒去除內(nèi)毒素效果最好。

表4 質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素水平測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination of endotoxin levels in plasmid DNA

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要成分脂多糖，當(dāng)細(xì)菌裂解時(shí)會(huì)釋放出來(lái)[4]。內(nèi)毒素表面帶負(fù)電荷、易形成微囊結(jié)構(gòu)的特性，使得幾種常用質(zhì)粒提取方法，如沉淀法、硅基質(zhì)法、陰離子交換法等[5]，很難將DNA與內(nèi)毒素徹底分開。

有文獻(xiàn)報(bào)道，內(nèi)毒素能顯著降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率[6]。內(nèi)毒素與DNA競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)染試劑，影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中目的DNA的攝取。內(nèi)毒素還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)生非特異性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果的誤讀。有研究表明，細(xì)菌內(nèi)毒素可降低基因免疫小鼠存活率和產(chǎn)仔率[7]。此外，通過有機(jī)試劑Triton X-114反復(fù)萃取可以顯著降低質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量[8]。另有報(bào)道，ZnSO4、多黏菌素B和γ-環(huán)糊精-聚氨酯共聚物可選擇性地去除DNA溶液中的內(nèi)毒素[9-11]。

內(nèi)毒素能與鱟試劑發(fā)生特異性的反應(yīng)，基于此原理的檢測(cè)方法主要有凝膠法、濁度法和比色法[12-14]，其中凝膠法速度快、特異性好、操作方便，被各國(guó)藥典收錄。當(dāng)各種內(nèi)毒素檢測(cè)方法得出的檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，以凝膠法為準(zhǔn)。凝膠法也存在如判斷結(jié)果有主觀性影響和靈敏度差等問題。有研究表明，鱟試劑檢測(cè)DNA疫苗可行[15]。顯色基質(zhì)法依據(jù)供試品內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量在一定時(shí)間內(nèi)成正相關(guān)的原理，其優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好、靈敏度較高。有文獻(xiàn)報(bào)道，利用顯色基質(zhì)法可以定量測(cè)定質(zhì)粒中內(nèi)毒素[16]。本研究選用上述兩種方法檢測(cè)市售6種不同試劑盒提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素水平，由于檢測(cè)試劑靈敏度、樣品稀釋、重復(fù)數(shù)等限制，試驗(yàn)定量結(jié)果也存在一定誤差。檢測(cè)結(jié)果表明，市售質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量不同，其中標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素的試劑盒均采取了一定的去除內(nèi)毒素措施。而QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒較康為世紀(jì)高純質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素水平低，是由于陰離子交換柱的特異性較好。如需獲得更高純度質(zhì)粒DNA，仍需結(jié)合色譜純化技術(shù)。

常規(guī)酶切、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及PCR等對(duì)內(nèi)毒素沒有要求，但原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染、敏感細(xì)胞轉(zhuǎn)染、懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因治療研究、基因沉默及顯微注射均需要低內(nèi)毒素質(zhì)粒。本研究結(jié)果為質(zhì)粒提取試劑盒的選擇提供基礎(chǔ)。市面上質(zhì)粒提取試劑盒均能滿足大多數(shù)的分子生物學(xué)研究，6種提取試劑盒提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素水平不同，使用時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇。