正常腦組織和腦卒中組織的電阻抗頻譜特性研究

楊 琳，代 萌，徐燦華，王 航，文治洪，史學(xué)濤，董秀珍*，付 峰*

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系，西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，西安 710032）

0 引言

腦卒中是一種嚴重的急性腦血管疾病，具有發(fā)病急和致死率高的特點，已成為我國首位疾病死因[1]。臨床實踐表明，早診斷、早治療是改善腦卒中患者預(yù)后的關(guān)鍵（3～6 h為黃金救治期）[2]?，F(xiàn)有腦卒中檢查技術(shù)（MRI和CT）因設(shè)備體積龐大、價格昂貴等原因，無法用于院前臨床緊急救治，致使大多數(shù)腦卒中患者無法得到及時的救治。因此，在臨床一線救治中，迫切需要一種便攜、造價低廉且適用于基層醫(yī)療單位等院前救治的腦卒中快速檢測技術(shù)。多頻電阻抗成像（electrical impedance tomography，EIT）是一種利用生物組織阻抗頻譜特性進行成像的技術(shù)，其通過體表電極向人體施加多種頻率電流，同時測量不同頻率處的電壓，然后采用一定的圖像重構(gòu)算法估計人體被測部位內(nèi)部的阻抗分布，最后基于組織的阻抗頻譜特異性區(qū)分組織類型，達到檢測疾病的目的。由于腦卒中組織和正常腦組織的阻抗頻譜存在明顯差異，所以多頻EIT有望實現(xiàn)腦卒中快速檢測。此外，多頻EIT還具有無創(chuàng)、無輻射、設(shè)備便攜等優(yōu)勢，因此非常適合作為院前救治中快速檢測腦卒中的技術(shù)。

準確的正常腦組織和腦卒中病變組織的阻抗頻譜是開展多頻EIT檢測腦卒中研究的重要前提。到目前為止，已有研究小組開展了正常腦組織和腦卒中組織阻抗特性的研究。Surowiec等[3]測量了牛腦灰質(zhì)和白質(zhì)在20 kHz～100 MHz內(nèi)阻抗頻率特性；Gabriel等[4]在2 h內(nèi)測量了綿羊腦灰質(zhì)和白質(zhì)在10 Hz～20 GHz的阻抗頻譜特性；吳小明等[5]測量了家兔的缺血腦組織在1 Hz～1 MHz的阻抗譜；Dowrick等[6]測量了放置于4℃環(huán)境自發(fā)凝血的凝血塊的阻抗特性。但是，以上研究未同時測量正常腦組織和腦卒中組織的阻抗頻譜特性，導(dǎo)致無法系統(tǒng)地對比組織的阻抗頻譜。

針對上述問題，本文首先采用自體血注入法和光化學(xué)誘導(dǎo)法分別建立家兔腦出血模型和腦缺血模型；其次，分別測量離體15 min內(nèi)的腦白質(zhì)、灰質(zhì)、腦出血組織和腦缺血組織在10 Hz～1 MHz內(nèi)的阻抗頻譜；最后，系統(tǒng)性對比分析正常腦組織和腦卒中組織的阻抗頻譜。

1 方法

1.1 動物的麻醉與固定

以42只新西蘭大白兔為實驗對象，年齡：2個月，體質(zhì)量：（2±0.5）kg。在實驗開始前 2 h 禁水，4 h 禁食。開始麻醉階段，使用1.5%的戊巴比妥鈉（2 ml/kg）腹腔麻醉。待兔子鎮(zhèn)靜后，通過耳緣注射3%的戊巴比妥鈉（0.5 ml/kg）進行深度麻醉。在術(shù)中，1.5%的戊巴比妥鈉以1 ml/（kg·h）的速率進行腹腔注射，以維持兔子的麻醉狀態(tài)。兔子被固定在立體定位器上，使用眼睛和耳朵固定閂以俯臥體位固定。42只兔子被分為2組，顱內(nèi)出血模型和缺血模型各21只。本研究中的所有動物實驗方案均受到空軍軍醫(yī)大學(xué)動物管理和使用委員會的支持。

1.2 家兔腦卒中模型的建立

1.2.1 顱內(nèi)出血模型的建立

本文采用自體血注入方式制作腦實質(zhì)出血模型[7]。將兔子固定于立體定位儀，在矢狀縫左側(cè)5 mm與冠狀縫后5 mm處用牙科鉆鉆孔，深度以恰好碰到硬腦膜為宜，孔的直徑為1 mm，為注射血液做準備，如圖1（a）所示。采用心臟取血方式采血，向1 ml注射器內(nèi)注入0.5 ml的血液，將1 ml注射器固定于立體定位儀上；針頭順孔進入顱內(nèi)，根據(jù)解剖結(jié)構(gòu)選擇進針深度為11 mm，確保注血位置位于腦實質(zhì)；緩慢注血，注射時間為30 s；注血完成后5 min拔針，用骨蠟密封針孔，并縫合傷口。40 min后，采用過劑量麻醉方式將兔子處死，取腦，1只置于福爾馬林溶液，20只進行組織阻抗頻譜測量，測量組織包括出血組織（血凝塊）和腦白質(zhì)（位于注血位置對側(cè)）。

1.2.2 腦缺血模型的建立

本文采用光化學(xué)誘導(dǎo)法制作腦缺血模型[8]。在矢狀縫左側(cè)6 mm與冠狀縫后5 mm處，采用牙科鉆逐層鉆透顱骨的外板層和板狀層，暴露內(nèi)板層，并將內(nèi)板層打磨平整，形成不完全穿透顱骨的直徑5 mm圓形骨洞，電凝止血，將視野清理干凈，如圖1（b）所示。由耳緣靜脈按1.5 ml/kg的劑量緩慢注射3.5%Rose Bental（Sigma corporation）溶液。觀察兔眼顏色，出現(xiàn)玫瑰紅顏色改變后（通常為注藥后15 min）啟動冷光源，使單綠色光（波長540 nm，強度600 mW/cm2）通過光導(dǎo)纖維，光導(dǎo)纖維探頭接近骨洞洞口，垂直照射30 min，然后縫合傷口。待40 min后，采用過量麻醉方式處死兔子，取腦，1只置于福爾馬林溶液，20只進行組織阻抗頻譜測量，測量組織包括缺血組織和腦灰質(zhì)組織（位于缺血組織對側(cè)，光化學(xué)法制作的缺血組織主要為腦灰質(zhì)）。

圖1 2種腦卒中模型制作

1.3 組織阻抗譜測量與分析

1.3.1 組織阻抗頻譜測量

在取腦后，分離兔腦灰質(zhì)、白質(zhì)和腦卒中組織（出血組織或者缺血組織），2名實驗人員同時裝填正常腦組織和腦卒中組織于2個測量盒，以減少離體時間的影響，測量盒如圖2所示。測量盒有一個圓柱狀空腔，空腔直徑為5 mm，長度為15 mm。測量盒共有4個電極（均為銀電極），2個電極位于測量盒的兩個末端（激勵電極），呈圓盤狀，電極直徑為10 mm，厚度為0.5mm；另外2個電極位于測量盒的內(nèi)壁上（測量電極），呈環(huán)形分布，2個電極之間的距離為8 mm，如圖2所示。在本文中，我們采用四電極法進行測量以消除電極和接觸阻抗的影響[9]。

圖2 阻抗測量盒（單位：mm）

采用本研究小組建立的阻抗測量平臺開展阻抗測量[10]。當組織裝填完成后，將測量盒連接于Solartron 1260阻抗分析儀（Schlumberger，UK）。本文使用帶有接口1294A的阻抗分析儀Solartron 1260進行阻抗測量，通過軟件Zplot來控制采集參數(shù)和數(shù)據(jù)采集。采用0.2 mA ACRMS電流，通過2個激勵電極進行掃頻，測量頻率范圍為10 Hz～1 MHz，共51個頻點；采用2個測量電極測量電壓并計算2個測量電極之間的阻抗。為了控制測量條件，使用嬰兒培養(yǎng)箱（戴維，寧波）保持測量溫度維持在（37±0.3）℃，相對濕度維持在60%。在本研究的每一個實驗中，當一種組織測量完畢后，立即更換測量盒，測量下一種組織，保證所有組織測量均在動物死亡后15 min內(nèi)完成。

1.3.2 組織阻抗譜特性

使用Solartron 1260/1294測量方案可獲得阻抗Z=Zreal+jZimag。根據(jù)測量原理，組織的電導(dǎo)率（δ）和介電常數(shù)（ε）的計算公式[11-12]如下：

其中，S為測量盒的橫截面積，l為2個測量電極之間的距離，ω為角頻率。

因此，阻抗的實部和虛部可以被改寫為與測量盒尺寸、電導(dǎo)率和介電常數(shù)有關(guān)的形式：

為了直觀地比較不同組織之間的阻抗特性，由公式（3）、（4）可以看出，如果令測量盒的橫截面積S=1 cm2，2個測量電極之間的距離l=1 cm，則可得到標準化后的阻抗實部和虛部。

在本文中，我們使用導(dǎo)納率 γ（等于 δ+jωε）、Zreal和Zimag表示組織的阻抗頻譜特性。

1.4 組織學(xué)檢查

為了評估腦卒中病灶的組織病理性變化，處死動物后，從2種腦卒中模型的兔腦中分別挑選正常腦白質(zhì)、腦灰質(zhì)、出血組織以及缺血組織（直徑為1 cm）置于10%的福爾馬林溶液中24 h。然后，每種組織樣本被切為3 mm厚的薄片進行HE染色。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 20.0（IBM Software，Armonk，NY，USA）進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗比較不同頻率處阻抗的差異，P＜0.05被認為有顯著差異。

為了達到利用多頻EIT檢測腦卒中的目的，首先，需要從正常組織中鑒別出腦卒中病灶，為此，我們對比分析正常腦組織和腦卒中組織的阻抗在所有頻率處的差異，具體計算公式如下：

其中，Δδ和Δ（ωε）分別表示腦卒中組織與正常腦組織的電導(dǎo)率和導(dǎo)納率虛部差異；δstroketissue和δnormaltissue分別表示腦卒中組織和正常腦組織的電導(dǎo)率；（ωε）stroketissue和（ωε）normaltissue分別表示腦卒中組織和正常腦組織的導(dǎo)納率虛部。

其次，在腦卒中發(fā)病早期，不但要從正常腦組織中檢測出腦卒中，而且，需要鑒別腦卒中類型。不同類型腦卒中組織的阻抗隨頻率的變化特性可能是區(qū)分腦卒中類型的依據(jù)。為此，將測量頻段劃分為低頻段（10 Hz～1 kHz）、中頻段（1～100 kHz）和高頻段（100 kHz～1 MHz）3個子頻段，然后分別研究缺血組織和出血組織的阻抗在3個頻段內(nèi)的頻差變化特點，在3個子頻段內(nèi)，分別以10 Hz、1 kHz和100 kHz為參考頻率。具體計算公式如下：

其中，Δδf和 Δ（ωε）f分別表示腦卒中組織的電導(dǎo)率和導(dǎo)納率虛部在各子頻段內(nèi)的變化和分別表示腦卒中組織的電導(dǎo)率和導(dǎo)納率虛部分別表示腦卒中組織在參考頻率處的電導(dǎo)率和導(dǎo)納率虛部；fref為參考頻率。

2 結(jié)果

2.1 腦卒中模型驗證

在所有實驗過程中，動物保持正常的體溫和呼吸等生命體征。實驗中建立的腦出血模型如圖3（a）所示。圖3（b）為出血組織及其周圍腦白質(zhì)，從圖中可以看出，血液和腦白質(zhì)之間邊界清晰，并且出血組織中充滿大量的紅細胞，如圖3（c）所示。實驗中建立的腦缺血模型如圖4（a）所示，從圖中可以看出，缺血組織與正常組織之間的邊界清晰，并且缺血組織的細胞體積明顯大于正常腦灰質(zhì)，如圖4（c）、（d）所示。以上結(jié)果表明，本文成功建立了腦出血模型和腦缺血模型。

圖3 腦出血模型和病理圖

圖4 腦缺血模型和病理圖

2.2 正常腦組織與卒中組織的阻抗頻譜

圖5為正常腦組織和卒中組織的電導(dǎo)率和導(dǎo)納率虛部。從圖5中可以看出，白質(zhì)、灰質(zhì)以及缺血組織的電導(dǎo)率在整個頻段內(nèi)均隨頻率升高而增大；出血組織的電導(dǎo)率在10 Hz～100 kHz之間基本保持不變，但電導(dǎo)率在100 kHz～1 MHz之間隨頻率升高而增大。4種組織的導(dǎo)納率虛部隨頻率變化特性與電導(dǎo)率變化相同，特別是出血組織的導(dǎo)納率虛部在100 kHz～1 MHz之間隨頻率升高增加最為明顯（100 kHz和1 MHz處的導(dǎo)納率虛部具有明顯差異，P<0.05）。在整個頻段內(nèi)，出血組織的電導(dǎo)率均小于其他3種組織的電導(dǎo)率，而缺血組織的電導(dǎo)率介于腦白質(zhì)和腦灰質(zhì)之間。

圖5 正常腦組織和卒中組織的阻抗頻譜

2.3 正常腦組織與卒中組織的阻抗頻譜差異

圖6為正常腦組織和卒中組織的阻抗頻譜。從圖6中可以看出，缺血組織與白質(zhì)和灰質(zhì)的電導(dǎo)率差異在整個頻段內(nèi)隨頻率緩慢變化，基本保持在0.2倍。而出血組織與正常腦組織的電導(dǎo)率具有較大差異，特別是在高頻段（>100 kHz）差異最為明顯：與灰質(zhì)相比差異可達0.6倍，與白質(zhì)相比差異可達0.3倍。

缺血組織與白質(zhì)和灰質(zhì)的導(dǎo)納率虛部差異在整個頻段內(nèi)變化緩慢；而出血組織與正常組織的差異在整個頻段內(nèi)均較大，尤其在大于100 kHz范圍內(nèi)，差異可達2倍以上。

圖6 正常腦組織和卒中組織的阻抗頻譜差異

2.4 2種腦卒中組織的阻抗頻差變化特性

圖 7（a）表明，在低頻段（10 Hz～1 kHz）和中頻段（1～100 kHz），缺血組織的電導(dǎo)率呈線性增加（在低頻段內(nèi)，缺血組織的電導(dǎo)率增加了約10%；在中頻段內(nèi)，缺血組織的電導(dǎo)率增加可達20%）。但在這2個頻段內(nèi)，出血組織的電導(dǎo)率基本保持不變。在高頻段（100 kHz～1 MHz）內(nèi)，2種卒中組織的電導(dǎo)率都隨頻率升高而增加，但出血組織增加幅度明顯大于缺血組織。因此，在低頻段和中頻段，2種卒中組織的電導(dǎo)率隨頻率變化具有較大差異。

圖7（b）顯示，在低頻段，缺血組織的導(dǎo)納率虛部的變化幅度大于出血組織，達10倍以上；而在中頻段和高頻段，出血組織的變化幅度大于缺血組織。說明在整個頻段內(nèi)，2種卒中的導(dǎo)納率虛部隨頻率變化都存在明顯差異。

3 討論和總結(jié)

從腦卒中組織和正常腦組織阻抗頻譜對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織和腦白質(zhì)的電導(dǎo)率差異隨頻率升高而緩慢上升，差異最大約為20%；而且2種組織的導(dǎo)納率虛部差異在100 Hz～1 MHz范圍內(nèi)具有最大值，可達到50%。缺血腦組織與腦灰質(zhì)相比，電導(dǎo)率差異基本維持在20%，而導(dǎo)納率虛部差異較小。因此，為了區(qū)分正常組織和腦缺血組織，可能需要利用整個頻段內(nèi)的數(shù)據(jù)。此外，腦出血組織與正常腦組織無論是電導(dǎo)率還是導(dǎo)納率虛部均在高頻段（＞100 kHz處）存在最大變化，例如，出血組織和灰質(zhì)的電導(dǎo)率差異為50%，導(dǎo)納率虛部差異可達3倍，所以在利用多頻EIT檢測腦卒中時，為了區(qū)分腦出血組織和正常腦組織，應(yīng)著重關(guān)注高頻段信息（＞100 kHz處），即高頻段是鑒別腦卒中組織和正常腦組織的最優(yōu)頻率段。

圖7 2種腦卒中組織的阻抗頻差變化特性

從腦缺血組織和腦出血組織阻抗頻譜對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低頻段，腦缺血組織的電導(dǎo)率和導(dǎo)納率虛部相對變化（約7%）明顯大于出血組織（小于1%）；而腦出血組織的導(dǎo)納率虛部在中頻段和高頻段變化分別為16倍和4倍，明顯大于腦缺血組織（小于2倍）。因此，在利用多頻EIT檢測腦卒中時，為了區(qū)分腦出血組織和腦缺血組織，應(yīng)著重關(guān)注低頻段（10 Hz～1 kHz）和中頻段（1～100 kHz）信息，即低頻段（10 Hz～1 kHz）和中頻段（1～100 kHz）是鑒別腦出血組織和腦缺血組織的最優(yōu)頻率段。

綜上所述，本文首先建立了家兔腦出血和腦缺血模型，然后全面測量了正常腦組織和腦卒中組織在10Hz～1MHz內(nèi)的阻抗頻譜，并對比分析了正常腦組織和腦卒中組織的阻抗頻譜，為未來開展多頻EIT檢測腦卒中研究奠定了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。