軟骨細胞能量代謝的瓦氏效應和Crabtree效應

張宇標，李皓桓

(武漢大學人民醫(yī)院骨外科，武漢 430060)

關節(jié)軟骨覆蓋在大部分活動關節(jié)的滑膜面，是骨骼的重要結構之一，其表面光滑、富有彈性接近無摩擦，保證了關節(jié)的光滑[1]。關節(jié)軟骨不僅能在關節(jié)運動時減少關節(jié)之間的摩擦力，同時也能分散承重壓力，保護軟骨下骨組織[2]。關節(jié)軟骨無神經和血管，營養(yǎng)主要由滑液和關節(jié)囊滑膜層周圍的動脈分支供應。一旦出現損傷，自身無法修復[3]。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一存在的細胞，占關節(jié)軟骨體積的2%～10%，其余為軟骨外基質(主要成分為Ⅱ型膠原和蛋白聚糖)。在膠原纖維之間，散在分布著軟骨細胞，軟骨細胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細胞組成，軟骨細胞通過酶降解和基質分泌來調節(jié)細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的穩(wěn)態(tài)，這些軟骨細胞的能量代謝維持關節(jié)軟骨的正常組織代謝，一旦軟骨細胞的能量代謝平衡被打破，將嚴重影響關節(jié)軟骨的正常功能[4]。目前研究者對軟骨細胞的能量代謝方面研究尚不深入，現對軟骨細胞能量代謝的瓦氏效應和Crabtree效應研究進展進行綜述。

1 關節(jié)軟骨的構成及生理特點

1.1軟骨組織的構成及其各層次的生理特點 軟骨是由水(60%～85%)、ECM和軟骨細胞組成的無血管和神經組織[4-5]。ECM主要由膠原蛋白和蛋白聚糖聚集體組成[1]，其中Ⅱ型膠原占ECM中膠原蛋白的90%～95%，并形成與蛋白多糖聚集體交織的纖維。ECM中的第二大類分子是蛋白聚糖，蛋白聚糖與透明質酸相互作用形成蛋白聚糖聚集體。這種復合物維持了軟骨可壓縮、可拉伸和耐摩擦的特性，使其能夠在狹窄的關節(jié)環(huán)境中生存和發(fā)揮自身作用[6-7]。其他ECM成分包括軟骨寡聚蛋白、軟骨連接蛋白、透明質酸等。宏觀上，關節(jié)軟骨是多層次的異向性和異質性組織，可以分成表層區(qū)、中層區(qū)、深層區(qū)3部分。每個區(qū)域之間ECM結構、軟骨細胞表型和細胞形狀不同，同時作用也不同[8]。表層區(qū)的Ⅱ型膠原纖維與關節(jié)表面平行排列，可以抵抗由關節(jié)連接產生的關節(jié)面的剪切力。在軟骨表面區(qū)域，軟骨細胞尚未發(fā)育完全，體型小呈扁橢圓形，細胞長軸與軟骨表面平行，多為單個存在，細胞密度最大[9]。在軟骨的中央，軟骨細胞成群分布，每群2～8個細胞，這些細胞均由一個軟骨細胞分裂而來，故稱同源細胞群，電鏡下，軟骨細胞表面有許多小突起，胞質內有較多的粗面內質網和發(fā)達的高爾基復合體以及少量糖原和脂滴。40%～60%的中層區(qū)軟骨含有隨機排列的Ⅱ型膠原纖維和圓形軟骨細胞；在關節(jié)軟骨深層區(qū)，膠原纖維垂直于關節(jié)面排列。蛋白多糖含量從淺層到深層增加，而水化作用則由淺層到深層減少。

1.2軟骨細胞特點及其同能量代謝的相關匹配因素 關節(jié)軟骨中與ECM相比，軟骨細胞數量少、體積小，增殖和代謝能力低[10]。軟骨中含有高濃度乳酸和糖酵解代謝的各種酶，含氧低，能量來源于厭氧代謝途徑。軟骨下的骨皮質中分布有許多的微動脈、微靜脈和神經分支,一直延伸到軟骨下的鈣化軟骨層,營養(yǎng)深層軟骨。但維持軟骨細胞正常生理活動的營養(yǎng)物質絕大部分是通過關節(jié)液滲透，經基質彌散來營養(yǎng)軟骨細胞[11]。各種營養(yǎng)物質經過軟骨基質的彌散系數只有水的一半，這種彌散是一種被動過程，即在滑液流動時，軟骨能得到充分營養(yǎng)，而在關節(jié)制動時滑液停滯，分子彌散阻力增加，深部軟骨細胞營養(yǎng)獲得減少。所以在關節(jié)反復負載的情況下，才能保持正常軟骨的代謝。同時，軟骨下骨組織所分泌的營養(yǎng)物質，也能經彌散透過鈣化軟骨區(qū)向深層區(qū)的細胞提供能量[12]。軟骨組織中氧含量極低[11,13-14]，表層區(qū)稍高，為5%～10%，深層區(qū)可低至1%，而動脈血中的氧含量高達13%[15]，所以軟骨細胞內化和血管形成的固有缺陷阻止成人的關節(jié)軟骨進行任何實質性的自我修復[8]。因此，有別于血供豐富的其他細胞，軟骨細胞的內環(huán)境和能量代謝獨具特點。

軟骨無血管，滑液中氧含量相對較低和關節(jié)軟骨厚度較高，環(huán)境氧氣張力較低[10]。相比血氧供應充足的細胞(比如肝細胞)，軟骨細胞內線粒體數量少[16]，而該特點恰能與關節(jié)部位的低氧、缺血內環(huán)境相適應。有報道軟骨細胞生長最佳氧含量為5%[13]，在這一條件下，軟骨細胞ATP合成量顯著提高，其中絕大部分ATP通過糖酵解途徑中的底物水平磷酸化合成[17-18]。

2 軟骨細胞瓦氏效應

德國生理學家奧托·海因里希·瓦爾堡及其同事于20世紀20年代在腫瘤細胞中首先發(fā)現癌細胞在增殖過程中隨著乳酸產量的增加而呼吸減少，即細胞增殖速度越快，乳酸生產速率越高，這表明癌細胞主要依靠發(fā)酵代謝來產生ATP[19]。即使在氧氣較為充足的情況下，癌細胞也傾向于通過糖酵解而不是氧化磷酸化產生ATP[20]。這種代謝現象被稱為有氧糖酵解或瓦氏效應[21]。軟骨細胞的代謝在低氧條件下以糖酵解為主，但即使在高氧環(huán)境中(如21%氧含量，相對于軟骨細胞為高氧)，這種代謝模式仍能維持。研究者通過對比關節(jié)軟骨細胞在21%氧含量和低于1%氧含量下對外源性葡萄糖的攝入量及乳酸產量，發(fā)現這些細胞在21%氧含量下，絕大部分外源性葡萄糖仍然轉化成為乳酸，而非進入氧化磷酸化途徑，即所謂的“負巴斯德效應”[22]。同時他們發(fā)現，軟骨細胞在體外培養(yǎng)時(即21%氧含量)利用線粒體進行氧化呼吸以生成ATP，但這僅占總ATP量的25%左右[22-23]?？梢酝茰y，余下的ATP應該通過糖酵解進行合成。

缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的表達是“瓦氏效應”發(fā)生的基礎。HIF-1在低氧條件下穩(wěn)定表達，能調控葡萄糖攝入、糖酵解相關酶的表達，維持低氧下細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現，HIF-1是促使細胞適應低氧環(huán)境的重要蛋白，是一種由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基共同組成異源二聚體。β亞基在細胞核內恒定表達，而α亞基存在于細胞質內，只在低氧下表達[24]。HIF-1α參與缺氧代謝組織(如關節(jié)軟骨細胞)的低氧反應。在生長板中，發(fā)現HIF-1α是軟骨細胞活力、代謝和基質產生所必需的。軟骨細胞處在無血供的軟骨基質中，構成了一個低氧、低糖的環(huán)境，所需的營養(yǎng)物質和氧來自關節(jié)液滲透或彌散。HIF-1是維持低氧環(huán)境下軟骨細胞能量代謝穩(wěn)態(tài)的重要蛋白[25]。在氧充足時(如21%氧含量)，HIF-1α發(fā)生羥基化。腫瘤抑制因子與羥基化HIF-1α連接之后被泛素化酶識別；最終，泛素化的HIF-1α在蛋白酶體和溶酶體的共同作用下發(fā)生降解。正常細胞內HIF-1α的半衰期很短(<5 min)，表達量極低，往往較難檢測[24,26]，在低氧條件下，細胞內的輔氨酸羥化酶2，因缺乏氧這一催化因素，無法羥基化HIF-1α亞基上的兩個輔氨酸殘基，導致輔氨酸殘基不能與腫瘤抑制因子上的絲氨酸和組氨酸形成氫鍵，HIF-1α也就無法泛素化，進而可在細胞質內穩(wěn)定表達[26]。正常氧含量下，HIF-1α被細胞內的相關蛋白酶標記并且泛素化，隨后水解，因此在通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化偶聯獲取ATP的大部分細胞中，HIF-1α表達量極低，難以檢測。但是在某些細胞中，如軟骨細胞、髓核細胞、睪丸間質細胞和單核細胞，依然能表達并可檢測到HIF-1α[27]。核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)同樣能上調HIF-1α。NF-κB是細胞內的一大類蛋白家族，是重要的轉錄因子，負責調控數百種基因的表達。NF-κB家族包括NF-κB和Rel兩個亞族，其成員分別為p50、p52和RelA、RelB、c-Rel，其共同特點是具有RHD結構域(Rel-homology domain)，此結構域不僅可以使NF-κB家族的不同蛋白互相結合、形成同源二聚體或者異源二聚體，同時也是NF-κB家族結合DNA的位點[28]。Rel亞族的C端具有轉錄激活結構域，能激活基因轉錄；NF-κB亞族必須與Rel亞族通過RHD結合才能獲得轉錄基因的功能[28]。而且研究表明，氧濃度的高低不能影響NF-κB提高HIF-1α的轉錄和表達[29]，因此在低氧環(huán)境下的軟骨同樣存在NF-κB對HIF-1α的促進作用?；钚匝躅愔饕獊碓从诰€粒體，是細胞氧化呼吸過程中的副產物，包括超氧化物、羥自由基(·OH)、過氧化物(H2O2等)和單態(tài)氧等[30]?；钚匝躅愂羌毎麅鹊闹匾盘柗肿?，在HIF-1α缺氧條件下的調節(jié)作用機制復雜[25]。有研究表明，活性氧類不僅能維持細胞內的HIF-1α狀態(tài)穩(wěn)定[31]，還能通過激活NF-κB間接提高HIF-1α表達[32]。一氧化氮是維持細胞正常生理活動的重要物質，可通過抑制脯氨酰羥化酶結構域2的活性[33]使常氧下細胞內HIF-1α的降解減少[34-35]。同時一氧化氮和超氧化物之間的相互作用也介導HIF-1α調節(jié)。一方面，一氧化氮和超氧化物彼此反應產生多種能夠硝化、亞硝化或氧化蛋白質的活性中間體。另一方面，超氧化物導致內源性一氧化氮介導的細胞信號轉導和蛋白質的翻譯后修飾減少，這些可變效應導致在一氧化氮和超氧化物存在下HIF-1α穩(wěn)定性的差異調節(jié)[31]。

3 軟骨細胞Crabtree效應

在高濃度葡萄糖的環(huán)境下，軟骨細胞的氧攝入量處于抑制狀態(tài)，細胞內氧化磷酸化效應降低，導致細胞更多地依賴糖酵解合成ATP、生成乳酸。高濃度葡萄糖抑制細胞氧化磷酸化的這個現象被稱為Crabtree效應。盡管研究者已經提出了許多假設，但其觸發(fā)機制仍未知。Crabtree效應的產生也可能是幾個因素相互作用的結果[36]。目前為大多數研究者所接受的假設是兩種糖酵解酶(磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶)和線粒體ATP酶對游離胞質ADP的影響[36-37]。如果糖酵解過度活躍，其理論上可以超越線粒體ADP攝取，由于線粒體攝取的ADP是氧化磷酸化底物之一，這將限制ATP合酶作用的其他底物，繼而降低呼吸作用。不過因為線粒體腺嘌呤核苷酸轉位酶的米氏常數是糖酵解酶百分之一[38]，糖酵解超越線粒體ADP的攝取量不可能在體內發(fā)生，于是研究者得出結論，即使糖酵解酶增加糖酵解的活性，胞質ADP仍將通過線粒體來提供能量。糖酵解酶使用Mg2+-螯合的核苷酸作為底物，而線粒體腺嘌呤核苷酸轉位酶的實際底物是非螯合的核苷酸，因此糖酵解和線粒體之間游離ADP供能的最終競爭將取決于螯合和非螯合ADP之間的比例。如果ADP或呼吸道底物保留在細胞質中，則會導致呼吸通量下降。另一個提出的機制是線粒體外膜通過多孔通道的通透性調節(jié)膜和間質底物的接觸，并以此來調節(jié)氧化磷酸化[39]。向對Crabtree效應敏感的細胞中加入外部葡萄糖會在幾秒內觸發(fā)氧氣消耗的部分抑制，從而抑制基因表達和蛋白質的從頭合成。來自全軟骨厚度的軟骨細胞在剝奪葡萄糖時表現出氧氣消耗增強，與Crabtree現象一致[40]。軟骨細胞存在的Crabtree效應能顯著降低細胞的氧攝入量，以適應不同軟骨層面的低氧環(huán)境，這可能是維持低氧低糖環(huán)境下軟骨細胞能量代謝的穩(wěn)態(tài)的重要途徑[41]。通過對不同層面上的軟骨細胞研究，研究者發(fā)現這些細胞的氧攝入量大小與其所處的層面相關[42]：淺層軟骨細胞的氧攝入量比深層的細胞要少。Heywood小組做了更為詳細的研究設計，將同等數量的軟骨細胞分別暴露于低糖和高糖培養(yǎng)基下，同時檢測兩者的氧攝入量，發(fā)現在低糖環(huán)境下對氧的攝入量仍然顯著高于高糖環(huán)境[43]，而且高糖能有效抑制軟骨細胞的氧化磷酸化反應，由此確定體外培養(yǎng)的軟骨細胞同樣具有Crabtree效應。

4 小 結

軟骨細胞在體內處于低氧、低糖的環(huán)境下，細胞質中的HIF-1α可以穩(wěn)定表達，從而進入細胞核與HIF-1β組成HIF-1；HIF-1能干擾三羧酸循環(huán)，因此HIF-1可誘導軟骨細胞在低氧低糖的環(huán)境中以糖酵解途徑獲取所需的ATP量，維持細胞穩(wěn)態(tài)。當軟骨細進入體外培養(yǎng)環(huán)境時，暴露在相對高濃度氧(21%)中，在一定時間內，仍可以維持細胞內HIF-1α的穩(wěn)定性，所以軟骨細胞存在瓦氏效應，Crabtree效應與瓦氏效應的表現一致，區(qū)別在于Crabtree效應是由于高濃度的葡萄糖導致的，進一步的研究中應納入葡萄糖濃度這一因素，降低Crabtree效應對瓦氏效應的干擾，有助于更準確地探究軟骨細胞的能量代謝與瓦氏效應和Crabtree效應的關系。同樣也可以研究骨關節(jié)炎患者合并糖尿病是否存在Crabtree效應及其相互之間的關系。