新疆高尿酸血癥痰濁阻滯證患者炎性因子外周血基因表達水平及相關(guān)性研究

馬麗麗，王先敏

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院科研科，烏魯木齊 830000)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)主要是由于嘌呤代謝障礙從而引起尿酸排泄減少或過度產(chǎn)生所導(dǎo)致的一種疾病[1]，其與代謝性疾病，如高脂血癥、肥胖、代謝綜合征、糖尿病及心血管疾病等均有密切聯(lián)系[2-3]。調(diào)查研究顯示，HUA患病人群在美國占5%～10%，而接近17.1%的亞洲女性及26.1%的亞洲男性患有HUA，并且呈年輕化發(fā)展趨勢[4]。

相關(guān)報道的數(shù)據(jù)顯示，HUA患者體內(nèi)存在微炎癥狀態(tài),從遺傳的角度講，HUA的發(fā)生、發(fā)展與一些炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生的關(guān)鍵細胞因子的激活和(或)抑制作用有關(guān)，炎性因子長期發(fā)展會使微炎癥HUA逐漸向痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展，從而降低患者的生活質(zhì)量[5]。研究表明，炎癥信號通路髓樣分化因子88(myeioid differentiation factor 88,MyD88)/核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)中下游的關(guān)鍵核因子及促炎性因子MyD88、NF-κB、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白細胞介素(interleukin,IL)-1β等在痛風(fēng)炎癥表現(xiàn)中的作用顯著[6]。然而，作為痛風(fēng)發(fā)病的病理基礎(chǔ)，HUA炎癥反應(yīng)的發(fā)展是否與這一系列促炎因子相關(guān)，具體機制尚未完全明確闡述。前期流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，痰濁阻滯證是新疆地區(qū)維吾爾族、漢族HUA患者中分布最廣的證型，對HUA患者日常的飲食、睡眠、情緒等影響較大[7-8]。痰濕體質(zhì)的發(fā)生、發(fā)展同樣與炎性因子的表達密切相關(guān)[9]。因此本研究主要檢測中HUA痰濁阻滯證與非痰濁阻滯證患者外周血中促炎性因子MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β的基因表達水平差異，以期發(fā)現(xiàn)上述炎性因子在微炎癥HUA痰濁阻滯證中的表達水平及與血尿酸水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院2014年4月至2015年8月收治的74例HUA患者作為研究對象,根據(jù)HUA中醫(yī)證型診斷標準不同分為痰濁阻滯證組和非痰濁阻滯證組。痰濁阻滯證組48例，男41例，女7例，年齡36～70歲，平均(55±9)歲；體質(zhì)指數(shù)22.0～38.7 kg/m2，平均(27.18±0.54)kg/m2；非痰濁阻滯證組26例，男11例，女15例，年齡37～70歲，平均(57±9)歲；體質(zhì)指數(shù)21.3～34.6 kg/m2,平均(26.80±0.23)kg/m2。兩組患者性別、年齡、BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審查，患者均簽署知情同意書。

1.2HUA及中醫(yī)證型診斷標準

1.2.1HUA診斷與排除標準 血尿酸水平：男性>420 μmol/L,女性>360 μmol/L[10]。排除患有腎臟病變、痛風(fēng)石、急/慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的HUA人群；排除患有精神病、嚴重肝、心腦血管、腫瘤疾病的HUA人群。

1.2.2中醫(yī)證型診斷標準 痰濁阻滯證：伴有頭重如裹、神疲乏力、頭身困重、心悸、煩躁易怒、眩暈、胸悶氣憋、咽干口燥、健忘、頭目脹痛、口苦、口黏膩、浮腫、失眠等中任意6項即可診斷。非痰濁阻滯證：①氣虛證，伴有自汗、盜汗、多夢等任意2項癥狀可診斷；②腎虛證，伴有畏冷肢涼、腰痛、膝酸軟、腰酸、夜尿多等任意3項癥狀可診斷；③脾虛證，伴有唇甲色淡、面色萎黃、關(guān)節(jié)紅腫、食欲不振等任意3項癥狀可診斷；④濕熱證，伴有便秘、腸鳴矢氣、小便短黃等任意2項癥狀可診斷；⑤水濕停留證，伴有形體肥胖、面色紫暗、胃腸水聲轆轆、唇色紫暗等任意3項癥狀可診斷[10]。

1.3方法

1.3.1血液標本的采集以及生化指標檢測 在禁止進食12 h后采集2 mL靜脈血，將全血樣本1 000×g離心20 min收集上清，放置-20 ℃冰箱備用。干化學(xué)法測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、肌酐、尿酸。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測儀器與方法

1.3.2.1主要實驗儀器 全自動血液分析儀(日本Sysmex,XT-2000i)；全自動生化分析儀(中國TOSHBIBA公司,AU680)；恒溫箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠，F(xiàn)YL-YS-100L)；臺式高速冷凍離心機(美國Thermo公司,pic-17 75002416)；渦旋混合器(中國SCuLOGEX公司,HW-80A)；熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司,iQ5)；凝膠成像檢測儀(美國BIO-RAD公司,T100)；酶標儀(美國，Thermo公司賽默飛公司,MultiskanFC)。

1.3.2.2RT-PCR檢測方法 ①提取樣本總RNA：用Trizol法提取血液樣本中總信使RNA。②RNA電泳檢測：取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。③互補DNA逆轉(zhuǎn)錄合成、純化：使用日本TAKARA公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶按40 μL體系進行反轉(zhuǎn)錄，使用快速PCR純化試劑盒進行互補DNA純化。④目的基因PCR擴增：RT-PCR體系(25 μL)，每個目的基因重復(fù)3組，再加一組內(nèi)參基因(GAPDH基因)，共7個基因組。循環(huán)過程：95 ℃解鏈預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共進行55個循環(huán)，最后保持在4 ℃左右。⑤結(jié)果計算：將MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因的CT值減去內(nèi)參基因GADPH的CT值，得出差值(ΔCT)即為MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者血清指標的比較 痰濁阻滯證組外周血的FBG、TC、肌酐高于非痰濁阻滯證組，HDL-C低于非痰濁阻滯證組(P<0.05或(P<0.01)，兩組TG、LDL-C、尿酸比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組HUA患者血清指標的比較

HUA：高尿酸血癥；FBG:空腹血糖；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；a為Z值，余為t值

2.2兩組患者MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因表達的比較 痰濁阻滯證組外周血中MyD88、IL-1β基因表達水平低于非痰濁阻滯證組，NF-κB、TNF-α基因表達水平高于非痰濁阻滯證組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組患者MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因表達水平的比較 [M(P25，P75)]

HUA：高尿酸血癥；MyD88:髓樣分化因子88；NF-κB：核因子κB；TNF-α:腫瘤壞死因子α；IL-1β:白細胞介素1β

2.3痰濁阻滯證與非痰濁阻滯證中血尿酸與MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因相關(guān)性 痰濁阻滯證患者外周血NF-κB表達與尿酸呈負相關(guān)(r=-0.331，P=0.001)，IL-1β基因表達與尿酸呈正相關(guān)(r=0.274，P=0.006)，MyD88、TNF-α基因表達水平與尿酸無相關(guān)性(r=-0.092,P=0.366；r=-0.197，P=0.052)；非痰濁阻滯證中MyD88、NF-κB、TNF-α基因表達與尿酸呈負相關(guān)(r=-0.033，P<0.001；r=-0.150，P<0.001；r=-0.415,P<0.001),IL-1β基因表達水平與尿酸無相關(guān)性(r=0.013,P=0.144)。

3 討 論

新疆地處西北邊陲，一年中近大半年都處于寒冷氣候中，其主體民族的維吾爾族從游牧?xí)r期開始至今，較漢族人群，喜食牛羊乳類及酒類等肥甘厚味、辛辣炙煿之品以抵抗寒冷。因此痰濁阻滯證成為新疆HUA的主要證型[11]。本研究結(jié)果顯示，痰濁阻滯證患者中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物FBG、TC、肌酐高于非痰濁阻滯證，HDL-C低于非痰濁阻滯證組，這與血脂異常和HUA痰濁阻滯證關(guān)系密切的結(jié)論[7]一致。正如《素問·奇病論篇》：“肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿”，多食肥膩食物容易損傷脾胃，進一步減慢脾和胃的運化功能，從而對水谷精微物質(zhì)的代謝失去一定的控制，促使痰濕及水飲在體內(nèi)滋生，久郁化熱，說明新疆民族獨特的飲食習(xí)慣及氣候環(huán)境是形痰濕體質(zhì)的重要影響因素。

研究報道HUA的損傷存在炎癥反應(yīng)[12]，其原理主要是由于人體內(nèi)尿酸鹽大量沉積，久之形成結(jié)晶，引發(fā)受累關(guān)節(jié)紅腫、熱痛，從而引起炎性病變，促使HUA進一步向急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，痛風(fēng)炎癥表現(xiàn)與介導(dǎo)代謝性疾病炎癥的重要的一類促炎癥分子密切相關(guān)，如MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β，這類促炎分子參與炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，促進痛風(fēng)炎癥發(fā)病[16-17]。本研究結(jié)果顯示：痰濁阻滯證患者外周血中NF-κB 基因與尿酸呈負相關(guān)，IL-1β基因與尿酸呈正相關(guān)，非痰濁阻滯證中MyD88、NF-κB、TNF-α基因與尿酸呈負相關(guān)，表明HUA炎癥反應(yīng)可能與MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因相關(guān)，但在不同的中醫(yī)證型中炎性因子MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β的基因表達水平與尿酸含量的相關(guān)性并不一致，為今后HUA不同中醫(yī)證型的基因鑒別提供了可能的理論基礎(chǔ)。NF-κB是Toll樣受體4的下游因子,Toll樣受體4被激活,導(dǎo)致下游的NF-κB活化增強,最終導(dǎo)致一系列炎性介質(zhì)(IL-1β、TNF-α等細胞因子)大量釋放,使HUA的微炎癥狀態(tài)加重。成熟的IL-1β被認為是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和HUA時調(diào)節(jié)炎癥的始動因素[18]：它通過激活I(lǐng)L-1受體使趨化因子和其他炎癥調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，導(dǎo)致大量中性粒細胞進入關(guān)節(jié)部位，促使HUA與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥產(chǎn)生和發(fā)展[19]。TNF-α是Toll樣受體4/NF-κB信號通路下游的關(guān)鍵分子，可以激活磷脂酶A2，使中性粒細胞的吞噬活性增加，增加的中性粒細胞進行合成，釋放TNF-α，TNF-α又反過來促進中性粒細胞聚集，并激活中性粒細胞產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，它們相互作用、相互影響，加重組織的損傷和炎癥，誘發(fā)HUA，提示NF-κB、TNF-α、IL-1β基因可能參與HUA的微炎癥反應(yīng)[20]。張劍勇等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4的表達水平降低會抑制NF-κB的基因活性，削弱了直接致炎因子TNF-α基因的分泌水平。以往Cri?an等[22]研究表明，IL-1β基因表達隨著血尿酸含量的增高而升高，兩者呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，痰濁阻滯證中IL-1β基因表達水平與尿酸呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果相符。而Zhu等[23]發(fā)現(xiàn)HUA合并糖尿病患者中TNF-α基因與血清尿酸水平呈正相關(guān)。本研究中非痰濁阻滯證患者TNF-α基因表達水平與尿酸呈負相關(guān)，與上述研究結(jié)果相反，其原因可能是TNF-α基因表達水平在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與HUA中趨勢相反，但均參與炎癥反應(yīng)。

HUA的痰濕體質(zhì)中炎性因子也存在異常水平[16]。本研究結(jié)果顯示，痰濁阻滯證組外周血中MyD88、IL-1β基因表達水平低于非痰濁阻滯證組，NF-κB、TNF-α基因表達水平高于非痰濁阻滯證組(P<0.01)。研究表明，TNF-α通過非p53依賴途徑促進NF-κB mRNA的表達升高[24]。由于HUA是痛風(fēng)的病理基礎(chǔ)，童曉霞[25]研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者體內(nèi)IL-1β基因表達顯著高于正常組。伴有濕痰阻絡(luò)癥的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α基因表達較正常組顯著降低，進一步說明IL-1β、TNF-α基因在痰濁阻滯證的痛風(fēng)及HUA中低表達[26]。

綜上所述，MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因表達水平在痰濁阻滯證與非痰濁阻滯證患者外周血的顯著差異為新疆微炎癥HUA的主要證型的基因鑒別提供了可能的理論依據(jù)。但由于本試驗樣本保存不當，日期過長，剔除后，所選取樣本量較小，故新疆的代表性不明顯，后續(xù)試驗需要加大樣本量，以發(fā)現(xiàn)此類促炎因子在新疆HUA炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中可能的作用機制。本研究為HUA微炎癥痰濁阻滯證的不同發(fā)病機制提供了可能的理論依據(jù)，也為新疆地區(qū)獨特的痰濁阻滯證型發(fā)病機制研究提供了思路和良好的基礎(chǔ)。