膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)視網(wǎng)膜色素變性給藥方式的研究進展△

代賀華 李根林

作者單位：100730 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京同仁眼科中心，北京市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是常見的遺傳性致盲眼底病，以夜盲、進行性視野缺損、特征性眼底改變及視網(wǎng)膜電流圖(electroretinogram，ERG)顯著異常或無波形為主要臨床特征。據(jù)報道其患病率范圍為1/5000～1/750[1]。目前RP的治療方法主要包括藥物治療、基因治療、細(xì)胞移植及視網(wǎng)膜假體等。在沒有其他有效的替代治療之前，臨床RP患者仍以藥物治療為主[2]。藥物治療主要通過神經(jīng)保護來延緩疾病的發(fā)展，其中神經(jīng)保護藥物主要依賴于神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)。NTFs可促進神經(jīng)細(xì)胞生存分化，抑制細(xì)胞凋亡速度，提高光感受器細(xì)胞的生存能力。除來源于神經(jīng)元和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的NTFs，源于膠質(zhì)細(xì)胞的NTFs日益受到重視，是目前學(xué)科研究熱點之一。本文就膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在干預(yù)RP方面的應(yīng)用現(xiàn)狀進行綜述。

1 GDNF的生物特性

GDNF首次在大鼠的B49膠質(zhì)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，最初將其描述為大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的營養(yǎng)因子[3]。GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員之一[4]，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生長、損傷及修復(fù)等有重要的神經(jīng)營養(yǎng)作用。GDNF發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的主要受體：GDNF家族受體和介導(dǎo)受體酪氨酸激酶Ret，主要信號通路：絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路[5]。

2 GDNF的神經(jīng)保護作用

GDNF是迄今為止文獻報道最強的多巴胺能因子，不僅可以保護多巴胺能神經(jīng)元，還可以修復(fù)多巴胺能神經(jīng)元[6]，因此GDNF在神經(jīng)退行性病變的研究中受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。隨著GDNF在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病及缺血性腦血管疾病等治療中應(yīng)用研究的進展，人們開始重視GDNF在退行性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用。

1993年GDNF首次被發(fā)現(xiàn)可以促進中腦多巴胺能神經(jīng)元的存活[3]，隨后GNDF又被證實可以增加突觸數(shù)量[7]和促進各種神經(jīng)元[8]的存活，包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[9]和光感受器[10]。視網(wǎng)膜的GDNF表達增加，可以延緩視網(wǎng)膜變性模型中的視桿細(xì)胞的死亡，并能降低嚴(yán)重氧化應(yīng)激狀態(tài)下的視網(wǎng)膜變性[11]。GDNF主要通過感光細(xì)胞介導(dǎo)的直接機制和Müller細(xì)胞介導(dǎo)的間接機制來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。

3 GDNF的新型給藥方式

由于GDNF的半衰期相對較短，生物利用度低，靶向細(xì)胞遞送能力差，因此持續(xù)釋放藥物是必要的。雖然反復(fù)玻璃體內(nèi)注射藥物可以提高局部藥物濃度，但這種給藥方式有潛在風(fēng)險，包括感染性眼內(nèi)炎、眼壓升高、視網(wǎng)膜血管閉塞和視網(wǎng)膜脫離[13]。為克服重復(fù)玻璃體內(nèi)注射藥物的并發(fā)癥，GDNF長期遞送系統(tǒng)如經(jīng)病毒或非病毒介導(dǎo)的基因治療，聚合物釋放系統(tǒng)，以及細(xì)胞/細(xì)胞替代療法[14]成為研究熱點?，F(xiàn)就近年GDNF的新型給藥方式予以介紹。

3.1基因工程法介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)基因工程法介導(dǎo)GDNF釋藥技術(shù)根據(jù)載體的不同，可分為病毒和非病毒載體介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)?；蜣D(zhuǎn)染依賴于給藥途徑：視網(wǎng)膜下腔給藥主要轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)和感光細(xì)胞，玻璃體腔給藥主要轉(zhuǎn)染神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[2]。

3.1.1經(jīng)病毒載體介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)用于治療RP基因治療的病毒載體主要包括慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)等。AAV由于其安全性和易操作性而被優(yōu)先用于視網(wǎng)膜的基因傳遞[15]。

Sanftner等[16]研究通過含有雞的肌動蛋白啟動子/巨細(xì)胞病毒立即早期增強子(the chicken-actin promoter/immediate early cytomegalovirus enhancer，CBA)的AAV載體驅(qū)動人GDNF基因，將AAV-CBA-GDNF轉(zhuǎn)移到RP模型(TgN S334ter-4)視網(wǎng)膜下，通過對外核層厚度的形態(tài)學(xué)進行分析，視桿細(xì)胞的存活率增加，ERG大幅增加，視網(wǎng)膜功能得到改善。但是60 d后失去了治療效果，可能是由于光感受器細(xì)胞分泌GDNF逐漸喪失。

Müller細(xì)胞貫穿整個視網(wǎng)膜，面向玻璃體面，并且本身釋放NTFs[17]，即使視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡了，它仍可以繼續(xù)提供NTFs，因此成為了基因?qū)氲膫溥x細(xì)胞。Dalkara等[18]設(shè)計了一個AAV衣殼變體——ShH10，通過玻璃體內(nèi)注射，高效、定向轉(zhuǎn)染Müller細(xì)胞，使Müller細(xì)胞過表達GDNF。ERG、外核層厚度、內(nèi)叢狀層的厚度和感光細(xì)胞外節(jié)段長度均證實了經(jīng)玻璃體腔轉(zhuǎn)導(dǎo)Müller細(xì)胞分泌的GDNF是治療視網(wǎng)膜變性一個安全、有效和可持續(xù)的方法。

3.1.2非病毒載體介導(dǎo)的GDNF釋藥方式非病毒載體主要包括DNA納米粒、陽離子聚合物型載體和脂質(zhì)體載體等。

3.1.2.1DNA納米粒介導(dǎo)GDNF的釋藥方式Ishikawa等[19]通過電穿孔將粒子攜帶的GDNF導(dǎo)入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，改善視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷程度。Touchard等[20]研究顯示，在RCS大鼠睫狀肌中單次電轉(zhuǎn)移30 μg GDNF編碼質(zhì)粒后，持續(xù)產(chǎn)生GDNF至少7個月。形態(tài)學(xué)、ERG和視功能分析均表明這種GDNF的持續(xù)釋放可延遲光感受器和視網(wǎng)膜功能喪失至少70 d，同時提出了高濃度的GDNF持續(xù)釋放存在潛在的視網(wǎng)膜毒性。

3.1.2.2陽離子聚合物型載體介導(dǎo)GDNF的釋藥方式眼部給藥肽(peptide for ocular delivery，POD)是一種新型的陽離子滲透肽，可以穿透視網(wǎng)膜的RPE、光感受器和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[21]。當(dāng)它與聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)結(jié)合(PEG-POD)時，可以將質(zhì)粒DNA運輸?shù)匠赡晷∈笠暰W(wǎng)膜的RPE。含GNDF的PEG-POD納米顆粒(PEG-POD-GNDF)主要用來研究其抑制光感受器凋亡的能力。Read等[22]研究發(fā)現(xiàn)，將PEG-POD-GNDF注射到視網(wǎng)膜下腔后細(xì)胞凋亡率顯著降低，光照14 d后外核層的厚度比對照組厚23.6%～39.3%，7 d后ERG的功能反應(yīng)性較對照組高27%～39%，并活化了Müller細(xì)胞。Binder等[23]將PEG-POD、PCPG-GDNF NPs注入成年Balb/C鼠的視網(wǎng)膜下，3周后，減輕了藍光引起的光感受器退化，37 d后結(jié)構(gòu)和功能上得到持續(xù)挽救，注射77 d后僅結(jié)構(gòu)上得到持續(xù)挽救。

3.2聚合物釋放系統(tǒng)介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)微粒因持續(xù)釋放活性物質(zhì)而得到關(guān)注，2種不同結(jié)構(gòu)類型的微粒通常用于遞送活性物質(zhì)：微囊和微球。

3.2.1細(xì)胞包囊技術(shù)及其介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)細(xì)胞包囊屬于微膠囊結(jié)構(gòu)，細(xì)胞包囊技術(shù)(encapsulated-cell technology，ECT)的目標(biāo)是包囊細(xì)胞在靶位點上持續(xù)釋放治療藥物，而不會引起任何免疫反應(yīng)。進行臨床試驗的ECT設(shè)備有NT-501和NT-503，其中NT-503的臨床試驗因效果欠佳已被叫停，而NT-501仍處于2期臨床試驗[24]。近年來，在臨床前研究中已經(jīng)提出了各種ECT設(shè)計，特別是生物相容性好的藻酸鹽和膠原基水凝膠系統(tǒng)在體外和體內(nèi)的研究中均取得了可喜的成果。Wong等[25]研究報道了一個三維膠原微囊化培養(yǎng)系統(tǒng)，維持人胚腎(human embryonic kidney，HEK)293細(xì)胞的生長，在體外持續(xù)分泌GDNF長達30 d。復(fù)合膠原-海藻酸鈉支架是一個相互滲透的網(wǎng)絡(luò)，具有良好的生物相容性。Wong等[14]研究發(fā)現(xiàn)將HEK293細(xì)胞封裝在由Ⅰ型膠原和海藻酸鈉組成的玻璃體內(nèi)注射凝膠中，在健康的大鼠眼睛里可以檢測到GNDF的連續(xù)釋放至少14 d。將凝膠植入營養(yǎng)不良的RCS大鼠眼內(nèi)可以維持光感受器存活達28 d。

3.2.2微球技術(shù)及其介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)不同于微膠囊，微球(microspheres，MSS)內(nèi)的活性物質(zhì)是分散的，可生物降解的MSS是一種新興的治療眼慢性病的工具，它可以在靠近眼周和眼內(nèi)的靶點釋藥，并且釋藥后被降解[26]。聚乳酸-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)是最常用的生物可降解聚合物，其中艾爾建傲迪適(Ozurdex?)已經(jīng)用于臨床實踐，由PLGA組成的眼內(nèi)藥物釋放系統(tǒng)在體內(nèi)逐漸降解為水和二氧化碳，并被眼內(nèi)組織清除[27]。

Andrieu-Soler等[28]使用水-油-水乳化溶劑萃取蒸發(fā)將重組人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子封裝于PLGA微球中，注入出生后11 d的rd1/rd1小鼠玻璃體腔內(nèi)，于出生28 d時檢查視網(wǎng)膜變性程度，顯示小鼠視桿細(xì)胞光感受器變性顯著延遲，視紫紅質(zhì)陽性信號增加，細(xì)胞外核層的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，ERG顯示b波升高。García-Caballero等[29]研究中將GDNF和Vit E包裝入PLGA微球內(nèi)，顯示在體外持續(xù)釋放GDNF達24周，這種新劑型的GDNF/VitE單次注入兔眼玻璃體腔內(nèi)，可持續(xù)釋放GDNF至少6個月。

3.3細(xì)胞移植介導(dǎo)的GDNF釋藥技術(shù)近年來細(xì)胞移植干預(yù)視網(wǎng)膜疾病越來越受關(guān)注。Gregory-Evans等[30]利用胚胎干細(xì)胞來遞送神經(jīng)保護分子到TgN S334ter-4鼠的視網(wǎng)膜。將基因修飾后分泌GDNF的小鼠胚胎干細(xì)胞懸液注入出生21 d的TgN S334ter-4鼠玻璃體腔內(nèi)，出生后90 d時在視網(wǎng)膜內(nèi)界膜可檢測到胚胎干細(xì)胞分泌綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，出生后45 d冰凍切片中顯示分泌GFP的細(xì)胞整合到視網(wǎng)膜內(nèi)層，但未遷移至外核層。在初始滯后期后，周邊視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞計數(shù)顯著增高。Gamm等[31]向單側(cè)RCS大鼠的視網(wǎng)膜下植入人神經(jīng)前體細(xì)胞(human neural progenitor cells，hNPC)，hNPC經(jīng)基因修飾分泌GDNF，出生后150 d，組織學(xué)顯示hNPC在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮層之間形成幾乎連續(xù)的色素層，在視網(wǎng)膜內(nèi)層也有分布，同時觀察到存留的視錐細(xì)胞。Hu等[32]研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有重要的保護作用，其中BDNF和GDNF是關(guān)鍵的NTFs。Tzameret 等[33]研究證實，給予RP的大鼠移植BMSCs 后可救援感光細(xì)胞，明顯改善視功能。

3.4利用小分子觸發(fā)器誘導(dǎo)產(chǎn)生GNDF間接神經(jīng)保護是一種新興的替代方法。隨著對生長因子誘導(dǎo)和釋放的日益了解，利用小分子物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生GDNF逐漸成為研究的熱點。已證實GNDF可以被不同的小分子誘導(dǎo)[8]，如抗抑郁藥[34]、丙戊酸鈉[35]。

研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉的全身治療營救了光感受器變性的rd10小鼠的部分光感受器[35]。但以前臨床研究顯示視力并沒有提高[36]。Baranov等[37]觀察了一種新型的小分子GSK812，在其濃度低于50 nmol·L-1時即可誘導(dǎo)產(chǎn)生GDNF，并發(fā)現(xiàn)無論是向健康的還是患病的小鼠的玻璃體腔內(nèi)單次注射GSK812，其視網(wǎng)膜內(nèi)的GDNF mRNA和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)。之后他們研發(fā)了一種可以持續(xù)釋放的混懸液，向C57Bl/6小鼠的玻璃體內(nèi)注射GSK812混懸液后，GDNF的mRNA水平(>1.8倍)及蛋白質(zhì)水平(>2.8倍)均明顯上調(diào)。GSK812引起rho-/-小鼠外核層光感受器細(xì)胞數(shù)目產(chǎn)生2倍的差異。在RCS大鼠中，GSK812的注射長期拯救了光感受器和外節(jié)段，并且保留了其功能。

4 問題與展望

GDNF治療RP的新型給藥方式提高了GDNF的生物利用度，給治療RP帶來了希望，但仍有許多問題尚待解決。首先應(yīng)該考慮到動物與人體的差異性，比如干細(xì)胞介導(dǎo)GDNF的倫理問題等。其次，在給藥方式上，局部給藥仍造成一定的眼組織損傷，如何在不損傷眼組織的條件下，使GDNF維持以穩(wěn)定的濃度靶向治療RP將是一個研究方向，如通過全身給藥，或者以滴眼液的方式給藥。最后，如何調(diào)控GDNF的分泌和表達水平仍需進一步探討與研究。相信隨著對GDNF給藥方式研究的不斷深入，GDNF治療RP將更加安全、高效、穩(wěn)定。