糖耐量受損患者血清e(cuò)NOS mRNA和TRB3 mRNA表達(dá)與疾病干預(yù)的相關(guān)性研究*

樊 萍，茍小林，李 娜

(咸陽市第一人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.內(nèi)分泌科，陜西咸陽 712000)

糖耐量受損(IGT)是2型糖尿病的前期階段，并具有血糖溫和升高和胰島素抵抗(IR)的特征。IGT患者已被證實(shí)存在較高的2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，過高的IR，血糖以及糖化血紅蛋白水平可以通過運(yùn)動(dòng)鍛煉和飲食調(diào)節(jié)來降低[1]。目前的研究顯示，人類循環(huán)內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)和同源蛋白3(TRB3)的表達(dá)可能與IR及糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-3]。本研究采用RT-PCR技術(shù)分析IGT患者血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA的表達(dá)，旨在評(píng)價(jià)生活方式干預(yù)治療IGT疾病的效果，并為2型糖尿病的有效預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年3月～2018年3月在咸陽市第一人民醫(yī)院就醫(yī)的58例IGT患者作為研究對(duì)象，均為初診且未接受治療。IGT患者均選擇運(yùn)動(dòng)鍛煉、飲食調(diào)節(jié)等生活方式干預(yù)治療。所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)的IGT診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖<7.0 mmol/L，負(fù)荷后2 h血糖7.8～11.1 mmol/L。男性35例，女性23例，年齡51.20±12.37歲。另選取53例同期體檢健康者納入對(duì)照組，其中男性32例，女性21例，年齡50.30±12.97歲，均排除糖尿病家族史。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組研究對(duì)象的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得咸陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到所有研究對(duì)象的知情同意。

1.2 試劑和儀器 血清葡萄糖和胰島素水平檢測(cè)采用羅氏MODULARP800全自動(dòng)生化分析儀。糖化血紅蛋白(HbA1c)采用高效液相色譜儀檢測(cè)。RNA提取試劑盒(上海久盛醫(yī)療用品有限公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(美國(guó)Promega公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTM XRS)(美國(guó)Bioad公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 方法：IGT患者于干預(yù)治療前及干預(yù)治療3個(gè)月后分別采集靜脈血液，HbA1c檢測(cè)采用全血，其余項(xiàng)目均采用血清進(jìn)行分析。所有研究對(duì)象均接受葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素釋放試驗(yàn)，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)通過空腹血糖(FPG)及空腹胰島素(FINS)計(jì)算得到，即HOMA-IR=FINS×FPG/22.5[4]。生活方式干預(yù)措施按照糖尿病飲食標(biāo)準(zhǔn)制定，每日飲食量包括主量約6兩加少量脂肪并同時(shí)進(jìn)行體育鍛煉，觀察時(shí)間為3個(gè)月。目標(biāo)是減輕體重約10%。為了使患者體育鍛煉目標(biāo)能實(shí)現(xiàn)，本研究制訂了最基本且易實(shí)現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)方式，即飯后快步行走0.5～1 h，行走約1～2千米路程，體質(zhì)較好的患者在此基礎(chǔ)上可適當(dāng)增加運(yùn)動(dòng)量或選擇自己喜好的其他鍛煉方式，活動(dòng)量控制以患者在運(yùn)動(dòng)中自測(cè)心率在100次/min以內(nèi)為宜，期間經(jīng)常督促、鼓勵(lì)患者堅(jiān)持以達(dá)到目標(biāo)。

1.3.2 PCR擴(kuò)增：采用Trizol法提取血清RNA。引物設(shè)計(jì)采用Pfimer5軟件，TRB3mRNA的引物序列為：上游5’-CTCTGGTCCTGCGTGATCTCAA-3’，下游5’-GTATGAGGCCCG7rGAGCTC AGTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為115bp。eNOSmRNA的上游引物序列為5’-CGAGAGATGTAGTGTGCG-3’，下游為5’-AAGCAGGGCCATGTGCCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為255 bp。采用β-actin作為內(nèi)參照，其引物序列為：上游5’-GCCATCTTGACTGGAT-3’，下游5’-ACCTGGAGCGCGGACAACTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為570 bp。cDNA測(cè)定采用熒光定量PCR儀。反應(yīng)條件：95℃20 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，以上反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72℃5 min于4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并通過圖像處理系統(tǒng)分析得到mRNA的吸光度。以β‐actin的吸光度為參考，求出eNOSmRNA和TRB3mRNA吸光度的變化值(△Ct)。mRNA表達(dá)量通過2-△Ct求得。

2 結(jié)果

2.1 各組糖尿病影響因素比較 見表1。治療前組的體重指數(shù)(BMI)，空腹血糖(FPG)，空腹胰島素(FINs)，HbA1c及HOMA-IR分別與治療后組比較顯著增高，治療后組的各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。

表1 各組糖尿病影響因素比較

2.2 各組血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA表達(dá)比較 見表2和圖1，圖2。TRB3mRNA在治療前組的表達(dá)顯著高于治療后組，治療后組的表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增高(F=93.27，P<0.01)；而eNOSmRNA在治療前組的表達(dá)顯著低于治療后組，治療后組的表達(dá)與對(duì)照組比較顯著降低(F=89.65，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA的表達(dá)比較

M.Marker(DL2000)；a.對(duì)照組；b.治療后組；c.治療前組。 M.Marker(DL2000)；a.對(duì)照組；b.治療前組；c.治療后組。

圖1 eNOSmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖圖2 TRB3mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 相關(guān)分析 在治療前組和治療后組中，血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性(r=-0.867，-0.826，均P<0.01)。在治療前組和治療后組中eNOSmRNA的表達(dá)分別與FPG，F(xiàn)INs，HbA1c水平及HOMA-IR有顯著負(fù)相關(guān)性[(r=-0.779，-0.739，-0.727，-0.755，均P<0.01)，(r=-0.726，-0.689，-0.667， -0.696，均P<0.01)]，而TRB3mRNA與各指標(biāo)則具有正相關(guān)性[(r=0.823， 0.769， 0.753， 0.797，均P<0.01)，(r=0.753， 0.697， 0.685，0.726，均P<0.01)]。

2.4 利用ROC曲線評(píng)價(jià)兩標(biāo)志物的價(jià)值 以治療前組和治療后組eNOSmRNA和TRB3mRNA的表達(dá)為因變量分析顯示，兩標(biāo)志物的AUC分別為[0.858(95%CI：0.756～0.960，P<0.01)，0.862(95%CI：0.753～0.970，P<0.01)]。eNOSmRNA和TRB3mRNA在最佳臨界值處評(píng)價(jià)IGT患者治療效果的敏感度和特異度分別為80.3%和87.5%；81.3%和90.2%。提示血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA對(duì)評(píng)價(jià)生活方式干預(yù)IGT的療效監(jiān)測(cè)有診斷意義。見圖3。

圖3 eNOSmRNA和TRB3mRNA的ROC曲線

3 討論

胰島素抵抗被定義為外周組織(骨骼肌和脂肪)對(duì)胰島素效應(yīng)的敏感性降低。最近的研究證明胰島素抵抗可能參與糖代謝異常的發(fā)生和發(fā)展過程。在糖代謝異常的早期階段，胰島素抵抗促進(jìn)胰島素的分泌[5]。這種效應(yīng)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生慢性過載并呈現(xiàn)過度增殖，長(zhǎng)期的作用會(huì)引起β細(xì)胞功能減退，導(dǎo)致胰島素的分泌不足進(jìn)而出現(xiàn)血糖水平升高。這種狀況使IGT或糖尿病的發(fā)生最終變?yōu)轱@性[5]。Lutz等[6]認(rèn)為IGT患者伴隨著溫和的血漿葡萄糖水平增加，反映了患者糖代謝呈現(xiàn)受損的狀態(tài)。IGT患者糖代謝異常被認(rèn)為可能是患者長(zhǎng)期暴露于胰島素抵抗而導(dǎo)致的結(jié)果[7]。本研究結(jié)果顯示IGT患者的BMI，F(xiàn)PG，F(xiàn)INs，HbA1c及HOMA-IR與對(duì)照組比較顯著增高(P<0.05或0.01)。這些結(jié)果印證了上述的IGT患者糖代謝的異常狀態(tài)。一氧化氮是由一氧化氮合酶(NOS)產(chǎn)生的氣體。NOS包括神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)，這三種亞型在骨骼肌組織均有表達(dá)，eNOS主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中。研究認(rèn)為NO對(duì)骨骼肌胰島素的敏感度以及葡萄糖的攝取利用具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。Feng等[9]分析108例IGT患者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗主要起始于血管內(nèi)皮。他們認(rèn)為eNOS功能障礙引起NO合成減少導(dǎo)致微循環(huán)血流量減少，從而降低胰島素對(duì)敏感組織的輸送。Hasegawa等[10]研究發(fā)現(xiàn)eNOS -//-小鼠(eNOS基因敲除小鼠)組織中胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取已被抑制。進(jìn)一步的研究顯示eNOS功能的恢復(fù)可以降低胰島素抵抗，增加組織對(duì)葡萄糖的利用。這些過程的作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，該通路的抑制可能促進(jìn)胰島素的發(fā)生[3]，降低循環(huán)eNOS活性，進(jìn)而影響NO的濃度，抑制胰島素介導(dǎo)的血管舒張，降低循環(huán)血流量，最終導(dǎo)致骨骼肌和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取減少以及血糖濃度升高[11]。另外的研究通過分析糖尿病大鼠模型的結(jié)果顯示有氧運(yùn)動(dòng)與抗阻力運(yùn)動(dòng)能刺激PI3K通路的磷酸化導(dǎo)致NO和eNOS濃度的增加，改善血管內(nèi)皮功能從而促進(jìn)糖尿病大鼠血管的舒張功能。這些過程最終導(dǎo)致大鼠的血糖和血脂水平降低以及胰島素抵抗改善[12]。提示血管內(nèi)皮功能的改善可能增加eNOS的活性，增強(qiáng)組織對(duì)胰島素的敏感度，改善胰島素抵抗的效應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示IGT患者生活方式干預(yù)前循環(huán)eNOSmRNA表達(dá)顯著低于干預(yù)后組(P<0.01)，推測(cè)IGT患者可能存在血管內(nèi)皮功能的損傷，進(jìn)而影響組織對(duì)胰島素的敏感度，并且促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生。進(jìn)一步地研究顯示治療后組eNOSmRNA表達(dá)仍然低于對(duì)照組，提示IGT患者血管內(nèi)皮的損傷未能完全恢復(fù)。盡管如此，治療前后循環(huán)eNOSmRNA的差異表達(dá)顯示生活方式干預(yù)可以有效地改善胰島素抵抗，修復(fù)受損的糖耐量。

Tribbles蛋白是最早在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物同源蛋白，其被發(fā)現(xiàn)可能參與PKB/AKT信號(hào)通路中的AKT磷酸化激活過程。TRB3作為Tribbles蛋白中的一員，通過直接結(jié)合AKT，阻礙AKTthr308，ser473位點(diǎn)的磷酸化，干擾PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路，引發(fā)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的減弱，增強(qiáng)IR在胰島素靶器官的發(fā)生[4]。曹梅等[14]通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠建立胰島素抵抗模型。他們的研究發(fā)現(xiàn)模型組中TRB3mRNA以及其蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加，而治療后TRB3mRNA表達(dá)則呈現(xiàn)下調(diào)。提示TRB3的上調(diào)可能影響骨骼肌和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用。研究發(fā)現(xiàn)TRB3在應(yīng)激條件下的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)并且介導(dǎo)多個(gè)糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)的生物學(xué)過程。進(jìn)一步的研究顯示禁食狀態(tài)下肝細(xì)胞中的TRB3表達(dá)增加抑制蛋白激酶B(參與PKB/AKT通路)ser473及thr308位點(diǎn)的磷酸化，損傷糖耐量導(dǎo)致血糖升高[3]。董靜等[15]認(rèn)為骨骼肌PKB/AKT磷酸化水平的增強(qiáng)可以下調(diào)TRB3的表達(dá)，這些過程可通過長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)。耐力運(yùn)動(dòng)被證實(shí)可能增加肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，降低血糖濃度進(jìn)而改善胰島素抵抗。本研究通過對(duì)58例IGT患者的分析顯示血清TRB3mRNA表達(dá)在治療前明顯增高(P<0.01)，而治療后TRB3mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，從而印證了生活方式干預(yù)治療IGT的有效性。進(jìn)一步顯示治療后該標(biāo)志物表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示生活方式干預(yù)治療IGT可能是一個(gè)持續(xù)的漫長(zhǎng)過程。生活方式干預(yù)治療被認(rèn)為是糖尿病最基礎(chǔ)的治療方法。糖尿病患者的高血糖和HbA1c水平可通過長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)和合理飲食得到有效控制，這些干預(yù)措施能減緩糖尿病相關(guān)慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。本研究結(jié)果顯示治療前后eNOSmRNA和TRB3mRNA的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，且兩標(biāo)志物的表達(dá)分別與FPG，F(xiàn)INs，HbA1c水平及HOMA-IR也具有顯著相關(guān)性(P<0.01)。推測(cè)兩標(biāo)志物與IGT的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其差異性的表達(dá)可以反映IGT治療后患者糖代謝的改善狀況。ROC曲線的分析結(jié)果顯示，血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA對(duì)IGT患者生活方式干預(yù)治療的療效監(jiān)測(cè)有診斷意義，并顯示出良好的敏感度和特異度。綜上所述，血清e(cuò)NOSmRNA和TRB3mRNA的檢測(cè)可應(yīng)用于評(píng)價(jià)生活方式干預(yù)治療IGT的效果，并可能為IGT及2型糖尿病的治療提供有效的基因?qū)W依據(jù)。