輪狀病毒VP4*高聚體的制備及其免疫保護性評價

李毅堅，羅國興，楊晗，賈連智，曾淵君，趙畢妍，李廷棟，葛勝祥

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輪狀病毒VP4*高聚體的制備及其免疫保護性評價

李毅堅1，羅國興1，楊晗2，賈連智2，曾淵君2，趙畢妍2，李廷棟2，葛勝祥2

1 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點實驗室，福建 廈門 361102 2 廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點實驗室，福建 廈門 361102

在前期工作中發(fā)現(xiàn)，截短的輪狀病毒VP4*蛋白 (aa 26–476) 在大腸桿菌中能夠以可溶形式表達，且在小鼠模型中具有較高的免疫原性和免疫保護性。本研究通過顆?；M一步提高VP4*蛋白的免疫保護性。通過37 ℃水浴加熱處理24 h使VP4*蛋白多聚化，通過高效液相色譜、透射電鏡、分析超離等分析VP4*蛋白顆?；潭?，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗分析顆粒化對VP4*蛋白與中和抗體反應(yīng)性的影響；通過差示量熱法分析VP4*高聚體的熱穩(wěn)定性；最后，通過小鼠母傳抗體模型研究顆?；瘜P4*免疫原性和免疫保護性的影響。結(jié)果表明，VP4*蛋白高聚體結(jié)構(gòu)均一，并且相比三聚體，具有更高熱穩(wěn)定性和中和抗體結(jié)合活性；在內(nèi)毒素<20 EU/mg的條件下，與鋁佐劑混合，刺激小鼠產(chǎn)生更高滴度的中和抗體；對輪狀病毒導(dǎo)致的腹瀉具有更高的免疫保護性。綜上所述，VP4*高聚體的研究為輪狀病毒基因工程亞單位疫苗的研制提供了更廣闊的思路。

輪狀病毒，基因工程疫苗，VP4*高聚體，中和抗體，免疫保護性

在全球范圍內(nèi)，輪狀病毒是引起5歲以下嬰幼兒急性腹瀉的主要病原體之一，每年導(dǎo)致約 20萬的死亡病例，主要發(fā)生在非洲和東南亞等發(fā)展中國家和地區(qū)[1]。目前有多種減毒輪狀病毒疫苗上市，其中Rotarix?(GlaxoSmithKline) 和RotaTeq?(Merck) 在世界各地廣泛接種[2]。隨著減毒疫苗的廣泛接種和醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，輪狀病毒導(dǎo)致的死亡率有所下降[3]。然而，在輪狀病毒導(dǎo)致的死亡率較高的發(fā)展中國家，減毒活疫苗的保護性較低[4-5]。此外，減毒活疫苗也存在一定的安全風(fēng)險，如增加腸套疊的風(fēng)險[6-7]。因此，研究更加安全、高效的輪狀病毒疫苗才能進一步降低輪狀病毒導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率。

高滴度的母源抗體是導(dǎo)致減毒活疫苗在發(fā)展中國家有效性低的原因之一[8-12]。相比減毒活疫苗，基因工程疫苗無需在體內(nèi)的復(fù)制過程，并且通過腸道外免疫可以在一定程度上避免母源抗體的干擾，有望解決減毒活疫苗在發(fā)展中國家有效性低的問題。

輪狀病毒刺突蛋白VP4能被胰酶水解形成VP8*和VP5*蛋白，并增強輪狀病毒的感染性[13-14]。其中VP8*蛋白可以與細胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)輪狀病毒吸附，而VP5*蛋白介導(dǎo)輪狀病毒的入胞[15-16]。VP8*與VP5*蛋白都能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，大多數(shù)針對VP8*蛋白的中和抗體能阻斷病毒吸附，而VP5*蛋白的特異性抗體能阻斷病毒入胞[17]。VP4蛋白在輪狀病毒感染過程中的關(guān)鍵作用使其成為輪狀病毒疫苗研究的關(guān)鍵靶標(biāo)。

全長的VP4蛋白具有較好的免疫保護性，但是其在真核系統(tǒng)的表達量較低，而在原核系統(tǒng)中以包涵體的形式表達[18-20]。2012年，聞小波等研究發(fā)現(xiàn)，VP8*蛋白核心區(qū) (ΔVP8，aa 65–223) 可在大腸桿菌中以可溶形式表達[21]，并且與破傷風(fēng)毒素CD4+T細胞表位P2融合表達可提高ΔVP8蛋白的免疫原性[22]。臨床研究的結(jié)果表明，P2-VP8具有更高免疫原性，但血清中和抗體的陽轉(zhuǎn)率僅為50%–66.7%[22]。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，將ΔVP8的N端延長至aa 26具有更高的免疫原性，且含有VP5抗原區(qū)的截短蛋白VP4* (aa 26–476) 在鋁佐劑條件下具有較高的免疫原性，并且在小鼠模型中能夠介導(dǎo)對輪狀病毒導(dǎo)致的腹瀉和排毒的免疫保護[23]。

盡管如此，在更高攻毒劑量的條件下，VP4*蛋白三聚體可能不能介導(dǎo)足夠的免疫保護。研究表明，DC細胞對顆粒性抗原具有更高的遞呈效率[24-26]。因此，我們嘗試通過不同的方式使VP4*蛋白形成顆粒以進一步提高其免疫原性和免疫保護性。本研究發(fā)現(xiàn)，VP4*蛋白三聚體在37 ℃加熱條件下可形成結(jié)構(gòu)均一的高聚體，并且高聚體比三聚體具有更高的免疫原性和免疫保護性，為輪狀病毒基因工程疫苗的研究提供了更廣闊的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

表達輪狀病毒VP4*蛋白的菌株為本實驗室在前期工作中制備[23]。輪狀病毒 (LLR) 和細胞 (MA104) 均來自北京萬泰生物有限公司的饋贈；實驗動物 (Balb/c小鼠)；酶及抗體：rDNA聚合酶購自TaKaRa公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa和NEB公司；T4 DNA連接酶購自華美生物工程公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、胰酶購自Promega公司；羊抗鼠IgG堿性磷酸酶標(biāo)記抗體購自晶美公司；輪狀病毒VP4*中和抗體是本實驗室自行制備篩選；DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen 公司；細胞培養(yǎng)用抗生素購自華北制藥廠；胎牛血清 (FBS) 購自GIBCO公司；PCR 引物合成及DNA測序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成；小量膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自北京Tiangen公司；DL2000的核酸Marker購自日本TaKaRa公司；SYBR Green DNA熒光染料購自Clare Chemical公司；考染試劑 (SDS-PAGE) 購自HyClone Pierce公司；去除內(nèi)毒素的Detoxi-Gel預(yù)裝柱購自Thermo Scientific公司；檢測細菌內(nèi)毒素的鱟試劑購自廈門鱟試劑廠；除此之外的其他試劑均為進口試劑或者是國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 輪狀病毒VP4*蛋白純化及高聚體制備及理化性質(zhì)分析

1.2.1 輪狀病毒VP4*蛋白的純化及高聚體制備

將表達VP4*蛋白的菌株在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)4 h，降溫到20 ℃后加入IPTG低溫誘導(dǎo)6 h。之后用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) (TB8.0) 吹溶菌液，超聲裂解，釋放目的蛋白。之后按照文獻報道的方法[23]，通過陰離子交換層析柱、苯基疏水柱分離純化。將純化后的VP4*蛋白透析至TB8.0緩沖液，通過Detoxi-Gel預(yù)裝柱去除內(nèi)毒素，并通過鱟試劑法檢測殘留的內(nèi)毒素。將去除內(nèi)毒素后的VP4*三聚體37 ℃處理24 h可形成高聚體。

1.2.2 高效液相色譜G5000 (HPLC) 分析VP4*蛋白的均一性及聚體大小

通過高效液相色譜TSK Gel G5000PWXL(TOSOH，Tokyo，Japan) 分析VP4*三聚體和高聚體的均一性及聚體大小。分析過程中所用緩沖液為TB8.0，流速為0.5 mL/min，UV檢測器波長為280 nm。

1.2.3 透射電鏡 (TEM) 分析VP4*蛋白的聚體形式

利用日本電子公司研制開發(fā)的100 kV透射電鏡，放大倍數(shù)為100 000倍。將蛋白樣品滴于鍍炭的銅網(wǎng)上，吸附10 min，濾紙擦去殘液，銅網(wǎng)上加一滴2%磷鎢酸溶液 (pH 7.0)，負(fù)染1 min，吸掉負(fù)染液，晾干；透射電鏡樣品室中觀察樣品的顆粒形態(tài)，拍照進一步分析保存。

1.2.4 分析型超速離心 (AUC) 分析VP4*蛋白的分子量

使用Beckman XL分析型超速離心機 (Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)，按照文獻報道的方法[27]，將樣品杯依次組裝完整，裝填蛋白樣品和緩沖液對照，對高聚體顆粒進行超離分析，利用其專有程序進行數(shù)據(jù)采集，并用SEDFIT軟件進行處理，作圖。

1.2.5 差示掃描量熱技術(shù) (DSC) 分析VP4*蛋白的熱穩(wěn)定性

DSC實驗所使用的儀器為GE公司差示掃描量熱儀Microcal VP capillary DSC。樣品填充完畢后運行程序，掃描范圍15–90 ℃，掃描速度為90 ℃/h。在Origin軟件中，將樣品曲線扣去對照曲線，得到樣品的CP和溫度的曲線，再讀取并計算m等參數(shù)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗比較VP4*蛋白的抗原性

為了驗證VP4*蛋白三聚體、高聚體與VP4*中和抗體的反應(yīng)性，以便評價其在形成高聚體的過程中重要的中和表位是否受到破壞。我們嘗試用間接ELISA方法對其進行評價，所用中和單抗均為VP4*蛋白免疫小鼠通過中和實驗篩選獲得[23,28]。參照文章報道方法[23,28-29]，抗原50 ng/孔包板室溫2 h，封閉2 h，將不同輪狀病毒VP4*中和抗體稀釋至100 ng/mL，分別加入相應(yīng)的微孔板，與抗原室溫反應(yīng)1 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(GAM-HRP)，并通過TMB進行顯色，通過酶標(biāo)儀 (TECAN，M?nnedorf，Switzerland)檢測波長450/630 nm處的吸光度。

1.4 小鼠免疫和母源抗體模型評價VP4*蛋白免疫原性及免疫保護性

1.4.1 小鼠免疫和攻毒試驗

所有的實驗方案均是按照廈門大學(xué)實驗動物中心的實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進行的。

免疫采用無特定病原體級 (SPF) 5–6周齡Balb/c雌性小鼠，每組實驗小鼠7只，通過眼眶靜脈叢采血法采集小鼠免前血。將VP4*蛋白三聚體及高聚體，采用肌肉注射方法免疫小鼠 (10 μg/只)。每隔2周免疫一次，共3次，每次免疫前以及最后一次免疫后14 d采集小鼠眼眶血進行血清抗體和中和抗體的檢測。

參照文獻報道方法[28]，第3針免疫2周后進行雌鼠交配，分籠后產(chǎn)崽，對7日齡的乳鼠進行LLR病毒灌胃攻毒，攻毒劑量為5×106TCID50/只小鼠，之后連續(xù)7 d進行監(jiān)測子代乳鼠的腹瀉情況。腹瀉評分：正常固體糞便，不腹瀉 (1分)；黃色軟糞便，腹瀉 (2分)；水樣便，嚴(yán)重腹瀉 (3分)。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測VP4*蛋白的免疫原性

血清抗體水平檢測參照文獻報道的方法[23]，將VP4*蛋白三聚體進行包被，將采集的小鼠血清進行連續(xù)10倍稀釋后，加入96孔中室溫反應(yīng)1 h，再用GAM-HRP進行檢測。

1.4.3 ELISPOT檢測VP4*蛋白的免疫中和活性

血清中和效價檢測參照文獻報道方法[30]，取采集的小鼠血清10 μL，56 ℃水浴30 min滅活補體，首孔100倍稀釋，并在此基礎(chǔ)上進行2倍梯度稀釋后，分別與100 μL胰酶處理后的LLR病毒混合；再取100 μL的血清-病毒混合物，加入鋪板在96孔板的MA104細胞中進行37 ℃感染14 h；對照組則用稀釋液與處理后的病毒混合，再與MA104細胞進行37℃感染14 h；孵育后再用7H11-HRP抗體 (實驗室篩選制備的HRP標(biāo)記的VP6抗體) 進行檢測。

抑制率=(1–實驗組孔內(nèi)的平均斑點數(shù)/對照組孔內(nèi)的平均斑點數(shù))×100%。通過四參數(shù)法計算50%抑制率時對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即NT50。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SPSS軟件21.0版本 (SPSS，Chicago，IL，USA) 進行統(tǒng)計分析，使用獨立樣本T檢驗比較兩組連續(xù)變量差異，如血清總抗體水平、中和抗體效價等。作圖采用GraphPad Prism V5.0及Adobe Illstrator CS6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪狀病毒VP4*蛋白高聚體的制備及其理化性質(zhì)分析

按照文獻中的方法對VP4*蛋白進行表達和純化，經(jīng)過兩步純化可以獲得純度高于95%的VP4*蛋白 (圖1A)[23]。將純化獲得VP4*蛋白在4 ℃透析50 mmol/L TB8.0后，通過Detoxi-Gel去除殘留的內(nèi)毒素，并通過鱟試劑進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化后的VP4*蛋白中內(nèi)毒素含量低于20 EU/mg。將純化后的VP4*三聚體37 ℃處理24 h，并通過分子篩分析37 ℃處理后與4 ℃樣品差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比4 ℃保存的樣品，37 ℃處理后的樣品保留時間從17.2 min縮短為12.4 min (圖1B)，這一結(jié)果提示，在37 ℃處理的過程中VP4*蛋白形成了高聚體。

圖1 VP4*蛋白純度和均一性的分析

為了進一步分析VP4*蛋白高聚體的均一性，我們分別進行了分析型超速離心分析和透射電鏡觀察。分析超離和電鏡結(jié)構(gòu)均顯示，VP4*蛋白高聚體的結(jié)構(gòu)較為均一 (圖2A和2B)。通過c(s) 和c(M) 分析發(fā)現(xiàn)，VP4*蛋白高聚體的分子量約為2 500 kDa，而VP4*蛋白的理論分子量約為50 kDa。因此，我們推測有50個左右的VP4*蛋白聚集形成高聚體。為了進一步比較高聚體和三聚體的熱穩(wěn)定性，分別對VP4*蛋白三聚體和高聚體進行了DSC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP4*蛋白三聚體有2個峰 (圖2C)，m1和m2分別為44.9 ℃和67.5 ℃，而VP4*蛋白高聚體僅在67.1 ℃出現(xiàn)的一個峰 (圖2C)。

圖2 VP4*蛋白理化性質(zhì)的比較

我們推測，m1可能代表三聚體解聚形成單體的過程，而m2代表單體徹底變性的過程。VP4*蛋白三聚體加熱到45 ℃后性質(zhì)發(fā)生改變，聚集后再解聚；而高聚體耐受67 ℃才開始發(fā)生解聚，熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于三聚體。

2.2 輪狀病毒VP4*蛋白三聚體與高聚體抗原性比較

為了比較VP4*蛋白三聚體和高聚體的抗原性，分別將二者以50 ng/孔的量包被在96孔微孔板上，封閉后與輪狀病毒VP4*中和抗體進行反應(yīng)，并通過GAM-HRP進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分中和抗體與VP4*蛋白高聚體的反應(yīng)顯著高于VP4*三聚體 (圖3)。這一結(jié)果提示，在VP4*蛋白高聚體形成過程中，能夠較好地保留VP4*蛋白的中和表位。

圖3 VP4*蛋白三聚體和高聚體與中和單抗反應(yīng)性的比較

2.3 輪狀病毒VP4*蛋白三聚體與高聚體免疫原性比較

為了比較VP4*蛋白三聚體和高聚體的免疫原性，將SPF級雌性Balb/c小鼠進行分組 (7只/組)，并分別免疫內(nèi)毒素合格的VP4*蛋白三聚體和高聚體 (內(nèi)毒素<10 EU/mg)，同時以滅活的LLR病毒作為陽性對照，以PBS作為陰性對照，佐劑為鋁佐劑。

第三針免疫后14 d，采集小鼠的眼眶血，進行抗體滴度及中和抗體滴度的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP4*蛋白三聚體的免疫原性與滅活病毒相當(dāng)，而無論是血清抗體滴度還是中和抗體滴度，VP4*蛋白高聚體均顯著高于三聚體 (圖4)。我們推測這可能與DC細胞對高聚體的遞呈效率更高有關(guān)。

圖4 VP4*三聚體和高聚體免疫原性的比較

2.4 輪狀病毒VP4*蛋白三聚體與高聚體免疫保護性研究

三針免疫后，將雌性小鼠與雄性小鼠進行交配。子代小鼠出生7 d后，以5×106TCID50的輪狀病毒LLR對子代小鼠進行灌胃攻毒，并在攻毒后連續(xù)7 d監(jiān)測乳鼠的腹瀉情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組乳鼠100%出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，而無論是通過VP4*蛋白三聚體、高聚體還是滅活病毒進行免疫，免疫組的腹瀉率、腹瀉水平以及持續(xù)時間均顯著低于對照組 (圖5，表1)。VP4*蛋白三聚體免疫組有20%的乳鼠出現(xiàn)腹瀉，而VP4*蛋白高聚體免疫組乳鼠均未出現(xiàn)腹瀉 (圖5，表1)。相比三聚體，高聚體具有更高的免疫保護性 (=0.03)。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)VP4*蛋白三聚體在37 ℃處理24 h，能夠形成較為均一、穩(wěn)定的高聚體結(jié)構(gòu)，并且在小鼠模型中，VP4*蛋白高聚體相比三聚體具有更高的免疫原性和免疫保護性，為輪狀病毒基因工程疫苗的研究提供了新的思路。

圖5 VP4*抗原對輪狀病毒導(dǎo)致的腹瀉的免疫保護性

相比傳統(tǒng)的減毒活疫苗和滅活疫苗，基因工程疫苗具有更高的安全性，并且大量數(shù)據(jù)表明，乙型肝炎病毒基因工程疫苗和乳頭瘤病毒基因工程疫苗均為病毒樣顆粒 (VLP) 疫苗，在結(jié)構(gòu)上與天然病毒較為接近，并且容易被DC細胞遞呈，具有較好的免疫保護性[24-26]。輪狀病毒VP4蛋白是重要的中和抗原，在病毒吸附、入胞過程中發(fā)揮著重要作用，是輪狀病毒疫苗研究的主要靶標(biāo)。本實驗室在前期工作中發(fā)現(xiàn)截短表達的VP4*蛋白 (aa26–476) 在小鼠模型中具有較高的免疫原性和免疫保護性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，VP4*蛋白經(jīng)37 ℃處理后可形成高聚體，并且相比三聚體具有更高的免疫原性和免疫保護性。一方面，與VLP疫苗類似，VP4*高聚體由于其粒徑較大，更容易被DC細胞遞呈；另一方面，高聚體與中和抗體的反應(yīng)性與三聚體相比顯著升高，說明在形成高聚體的過程中，較好地保留了VP4*蛋白的中和表位。此外，VP4*高聚體的穩(wěn)定性、均一性均較好，因此，該蛋白具有成為輪狀病毒基因工程疫苗的潛力。

表1 VP4蛋白免疫對子代小鼠接種輪狀病毒后腹瀉時間和嚴(yán)重程度的影響

aThe number of pups varied from group to group due to differences in the mating rate and the litter size.bThe onset day of diarrhea was calculated for the mice with diarrhea.cCalculated as the sum of daily fecal scores for 7 d post challenge/n. A cumulative score of 7 mean that none of pups in this group developed diarrhea.*Significant difference was found as compared to the PBS control group (<0.05).#Significant difference was found as compared between Trimer group with Polymer group (P<0.05).

目前VP4*蛋白高聚體成為輪狀病毒候選疫苗還需要開展大量的工作。首先，本研究基于動物源輪狀病毒LLR毒株開展研究，盡管VP4*蛋白高聚體在小鼠上具有較好的保護性，然而，動物源毒株的VP4基因序列與人源毒株的同源性較低，因此，在后續(xù)工作中我們將進一步表達人源毒株的VP4*蛋白，并研究其免疫原性和免疫保護性；其次，在輪狀病毒VLP疫苗的研究過程中發(fā)現(xiàn)，同一抗原在不同的動物模型中的免疫保護性具有顯著差異[31-32]，因此，我們將進一步研究VP4*蛋白在其他動物模型特別是腸道系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人體較為接近的小型豬以及非人靈長類動物中的免疫原性；最后，輪狀病毒基因型和血清型較多，我們還要進一步研究VP4*蛋白免疫血清的交叉中和活性，并進一步分析研究多價苗的必要性與可行性。

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Polymerization and evaluation of the protective efficacy of rotavirus VP4* proteins

Yijian Li1, Guoxing Luo1, Han Yang2, Lianzhi Jia2, Yuanjun Zeng2, Biyan Zhao2, Tingdong Li2, and Shengxiang Ge2

1 State Key of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infection Disease, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China 2 State Key of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infection Disease, School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China

In previous studies,In this study, we further improved the immunogenicity of VP4* by polymerization. The purified VP4* was polymerized through incubation at 37 ℃ for 24 h,and then the homogeneity of the particles was analyzed by HPLC, TEM and AUC, while the thermal stability and antigenicity was analyzed by DSC and ELISA, respectively. Finally, the immunogenicity and protective efficacy of the polymers analyzed by a mouse maternal antibody model. The results showed that VP4* aggregated into homogeneous polymers, with high thermostability and neutralizing antibody binding activity. In addition, VP4* polymers (endotoxin <20 EU/dose) stimulated higher neutralizing antibodies and confer higher protection against rotavirus-induced diarrhoea compared with the VP4* trimers when immunized with aluminium adjuvant. In summary, the study in VP4* polymers provides a new strategy for the development of recombinant rotavirus vaccines.

rotavirus, genetic engineering vaccine, VP4 polymer, neutralizing antibody, immunoprotective

May 16, 2018;

July 2, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 81501741), Fujian Province Science and Technology Innovation Platform (No. 2014Y2004).

Tingdong Li. Tel: +86-592-2183111; E-mail:litingdong@xmu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 81501741)，福建省科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新平臺 (No. 2014Y2004) 資助。

2018-08-01

10.13345/j.cjb.180208

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180731.1148.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)