凍融聯(lián)合灌注法優(yōu)化大鼠腎臟脫細(xì)胞支架的制備

胡東，張德迎，劉博，周宇，余熠杭，沈煉桔，龍春蘭，劉星，林濤，何大維，魏光輝

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凍融聯(lián)合灌注法優(yōu)化大鼠腎臟脫細(xì)胞支架的制備

胡東，張德迎，劉博，周宇，余熠杭，沈煉桔，龍春蘭，劉星，林濤，何大維，魏光輝

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 泌尿外科 兒童泌尿生殖發(fā)育與組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014

胡東, 張德迎, 劉博, 等. 凍融聯(lián)合灌注法優(yōu)化大鼠腎臟脫細(xì)胞支架的制備. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 307–318.Hu D, Zhang DY, Liu B, et al. Optimization of preparation of rat kidney decellularized scaffold by combining freeze-thawing with perfusion. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 307–318.

本研究旨在探索優(yōu)化腎臟脫細(xì)胞支架的制備方法，為腎臟組織工程及腎臟體外病理、毒理研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。取大鼠腎臟灌注PBS作為對(duì)照組 (Control組)，在不同流速下分別以十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS) 灌注(S組)，Triton X-100聯(lián)合SDS灌注(TS組)，反復(fù)凍融后Triton X-100聯(lián)合SDS灌注(FTS組)，制備腎臟脫細(xì)胞支架，并測(cè)定其流體分布及脈管阻力。HE染色、DAPI染色、DNA定量檢測(cè)脫細(xì)胞支架脫細(xì)胞程度，Masson染色、PAS染色、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脫細(xì)胞支架主要成分的保留和結(jié)構(gòu)的完整，掃描電鏡檢測(cè)支架的超微結(jié)構(gòu)，MTT法檢測(cè)支架的細(xì)胞毒性，ELISA檢測(cè)支架中生長(zhǎng)因子的含量。結(jié)果顯示，F(xiàn)TS組脫細(xì)胞用時(shí)較S組、TS組少，10 mL/min組支架脈管阻力較低，S組、TS組、FTS組流體分布與Control組存在差異。HE染色和DAPI染色顯示各組支架未見(jiàn)細(xì)胞成分殘留，DNA含量＜50 ng/mg。Masson染色和PAS染色可見(jiàn)細(xì)胞外網(wǎng)狀膠原及多糖，免疫組織化學(xué)染色見(jiàn)Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、層粘連蛋白(Laminin) 表達(dá)。掃描電鏡見(jiàn)支架呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)。MTT法檢測(cè)支架細(xì)胞毒性分級(jí)在0–1級(jí)之間。ELISA檢測(cè)提示FTS組VEGF、EGF、IGF-1、PDGF含量明顯高于S組和TS組。綜上，聯(lián)合凍融和灌注法能夠制備更為理想且有效的大鼠腎臟整器官脫細(xì)胞支架，為腎臟組織工程及腎臟體外病理、毒理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

組織工程，腎臟，脫細(xì)胞支架，凍融法，灌注法

目前我國(guó)慢性腎病患者的人數(shù)將近1.2億，其中有近5 000萬(wàn)患者處于終末期腎病[1]。對(duì)于慢性腎病乃至終末期腎病，目前的治療方案仍限于以透析和腎移植為主的腎臟替代治療[2]。其中，透析治療僅能部分替代腎臟的濾過(guò)功能，而無(wú)法替代腎臟的造血和內(nèi)分泌功能[3]；與此同時(shí)，腎移植的廣泛開(kāi)展仍受限于供體腎源的稀缺和移植后的排斥反應(yīng)等問(wèn)題[4]。隨著近年來(lái)組織工程的不斷發(fā)展，以上問(wèn)題的解決迎來(lái)了新的希望。組織工程組織/器官的構(gòu)建包括種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子這三個(gè)要素[5]。其中，支架材料的選擇是影響后期細(xì)胞行為的重要環(huán)節(jié)。目前組織工程應(yīng)用的支架材料包括天然及其改性修飾材料、人工合成材料和復(fù)合支架材料。由于重構(gòu)的腎臟需要連接至受體的循環(huán)系統(tǒng)，腎臟組織工程支架不僅要求其具有良好的生物相容性、低免疫原性等其他支架材料所共有的一般特性[6]，還要求其具有相對(duì)完整的脈管系統(tǒng)[7-8]。因此，通過(guò)去除組織中細(xì)胞成分而保留細(xì)胞外基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的腎臟脫細(xì)胞支架具有其他支架材料所不可替代的優(yōu)勢(shì)。而目前采用的脫細(xì)胞方法大都存在著脫細(xì)胞劑濃度較高、脫細(xì)胞時(shí)間較長(zhǎng)從而影響支架材料生物學(xué)特性的弊端。本研究通過(guò)聯(lián)合凍融和灌注法優(yōu)化了腎臟脫細(xì)胞支架的制備，用低濃度脫細(xì)胞劑在更短時(shí)間內(nèi)成功制備保留了細(xì)胞外基質(zhì)主要成分、空間結(jié)構(gòu)和對(duì)再細(xì)胞化具有重要意義的生長(zhǎng)因子的脫細(xì)胞支架，為腎臟組織工程重建提供了理想的支架材料來(lái)源及更優(yōu)的制備方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器、試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：12周齡清潔級(jí)健康SD大鼠180–220 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK (渝) 2017-0001。

主要儀器和試劑：蠕動(dòng)泵(保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司)，真空冷凍干燥機(jī)(Thermo)，大鼠VEGF、EGF ELISA試劑盒(欣博盛生物)，大鼠IGF-1、PDGF-BB ELISA試劑盒(Elabscience)，組織DNA提取試劑盒(OMEGA)，F(xiàn)ibronectin抗體(北京博奧森生物)，CollagenⅠ抗體、Collagen Ⅳ抗體、Laminin抗體(武漢博士德生物)。

1.2 腎臟脫細(xì)胞支架的制備及實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠麻醉后，無(wú)菌術(shù)取腎置于冰PBS溶液中，將24 G留置針經(jīng)腹主動(dòng)脈插至腎動(dòng)脈結(jié)扎固定后經(jīng)硅膠管連接至蠕動(dòng)泵，以4 mL/min的流速灌注肝素化PBS溶液(50 U/mL肝素鈉) 30 min作為Control組。之后分別以4 mL/min和10 mL/min流速灌注0.5% SDS溶液作為S4組和S10組；分別以4 mL/min和10 mL/min流速序列灌注0.1% Triton X-100溶液和0.5% SDS溶液作為T(mén)S4組和TS10組。將肝素化PBS灌注后的離體腎先后置于–80 ℃中 3 h、4 ℃中6 h反復(fù)凍融3次后，再次置入留置針并連接蠕動(dòng)泵，分別以4 mL/min和10 mL/min流速序列灌注0.1% Triton X-100和0.5% SDS溶液作為FTS4組和FTS10組。待各組離體腎脫細(xì)胞后灌注抗生素化的PBS溶液(100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素) 12 h洗脫Triton X-100和SDS。記錄脫細(xì)胞過(guò)程中腎臟大體形態(tài)變化，測(cè)量各組樣本干重。

1.3 腎臟脫細(xì)胞支架的檢測(cè)

1.3.1 生物力學(xué)檢測(cè)

將各組樣本以1 mL/min流速經(jīng)腎動(dòng)脈灌注PBS溶液，U型壓力計(jì)檢測(cè)腎動(dòng)脈入口處脈管阻力。將各組樣本以4 mL/min流速經(jīng)腎動(dòng)脈灌注PBS溶液，5 min后測(cè)量經(jīng)靜脈和輸尿管流出的液體量和經(jīng)器官壁流出的液體量。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

將各組樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水、包埋并切片，行HE染色、DAPI染色、Masson染色和PAS染色后于光鏡下觀察。

1.3.3 掃描電鏡

將各組樣本經(jīng)戊二醛固定后，梯度法丙酮脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)法干燥，真空噴鍍后掃描電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.3.4 DNA含量測(cè)定

將各組樣本于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12 h，按組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA，用紫外分光光度計(jì)于260 nm處測(cè)定DNA含量。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色

各組樣本的石蠟切片脫蠟并水化后，將切片加入0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液微波熱修復(fù)抗原12 min，3% H2O2孵育10 min后PBS清洗，0.5 % 牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，加抗CollagenⅠ抗體(1∶200)、抗Collagen Ⅳ抗體(1∶200)、抗Fibronectin抗體(1∶200)，抗Laminin抗體(1∶200)，室溫過(guò)夜，PBS清洗3遍，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶200) 室溫孵育1 h，PBS清洗，DAB顯色數(shù)秒后置于去離子水中終止顯色，蘇木素染核后于光鏡下觀察。

1.3.6 MTT體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

按照GB/T 16886.5-2003將經(jīng)PBS灌洗和未灌洗的腎臟脫細(xì)胞支架以多孔材料1 mg/mL的比例加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃浸沒(méi)24 h后加入10%血清制備浸提液。將大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E) 以5×103個(gè)/孔接種至96孔板，24 h后棄原培養(yǎng)基，分別加入含10%血清DMEM培養(yǎng)基(陰性對(duì)照組)、灌洗后支架的浸提液、未灌洗支架的浸提液、含0.1% Triton X-100的DMEM培養(yǎng)基、含0.5% SDS的DMEM培養(yǎng)基各100 μL，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。分別于6 h、12 h、24 h、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)下的光密度() 值，計(jì)算相對(duì)增殖率(Relative growth rate，RGR)：RGR (%)=(實(shí)驗(yàn)組值–空白值)/(陰性對(duì)照組值–空白值)×100%。

1.3.7 ELISA生長(zhǎng)因子檢測(cè)

將各組樣品經(jīng)真空冷凍機(jī)凍干稱重后，與RAPI裂解液共同在勻漿器中研磨，超聲10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清，按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定VEGF、EGF、IGF-1、PDGF-BB濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 脫細(xì)胞過(guò)程中腎臟大體形態(tài)及質(zhì)量

肝素化PBS灌注后離體腎為棕色，凍融3次后腎臟顏色稍變淺透明，0.1% Triton X-100溶液灌注后腎臟顏色稍變白，0.5% SDS溶液灌注后腎臟顏色逐漸呈分段分葉狀變白透明，最終全腎顏色呈均質(zhì)白色半透明狀(圖1A)。FTS組脫細(xì)胞時(shí)間較S組、TS組少，10 mL/min流速脫細(xì)胞時(shí)間較4 mL/min少(圖1B)。各組腎臟脫細(xì)胞支架質(zhì)量無(wú)明顯差異(圖1C)。

圖1 腎臟脫細(xì)胞過(guò)程大體形態(tài)及質(zhì)量(A：腎臟脫細(xì)胞過(guò)程大體形態(tài)變化；B：脫細(xì)胞過(guò)程用時(shí)；C：腎臟脫細(xì)胞支架干重)

2.2 生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

腎動(dòng)脈入口處脈管阻力測(cè)量顯示，10 mL/min流速脫細(xì)胞后支架脈管阻力較4 mL/min組低， S組、TS組、FTS組之間支架脈管阻力無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A)。流體分布測(cè)量結(jié)果顯示，各組腎臟脫細(xì)胞支架流體經(jīng)脈管和經(jīng)腎外壁流出分布無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與離體腎相比，各組腎臟脫細(xì)胞支架經(jīng)腎外壁溢出比例從12.22%增加至54.98% (圖2B)。

圖2 腎臟脫細(xì)胞支架生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果(A：脈管阻力檢測(cè)結(jié)果；B：流體分布檢測(cè)結(jié)果)

2.3 組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

HE染色顯示各組腎臟脫細(xì)胞支架腎皮髓質(zhì)部位全視野下未見(jiàn)細(xì)胞殘留，Control組腎皮髓質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞清晰可見(jiàn)(圖3)。DAPI染色顯示各組腎臟脫細(xì)胞支架腎皮髓質(zhì)部位無(wú)DAPI熒光染色，Control組腎皮髓質(zhì)可見(jiàn)與細(xì)胞核結(jié)合的DAPI熒光(圖4)。Masson染色顯示各組腎臟脫細(xì)胞支架腎髓質(zhì)部位僅見(jiàn)藍(lán)色網(wǎng)狀膠原纖維，結(jié)構(gòu)完整，Control組腎皮髓質(zhì)腎小球、腎小管組織結(jié)構(gòu)清楚，可見(jiàn)細(xì)胞外網(wǎng)狀膠原成分(圖5)。PAS染色顯示各組腎臟脫細(xì)胞支架腎皮髓質(zhì)部位僅見(jiàn)紫紅色基底膜，無(wú)結(jié)構(gòu)破壞，Control組腎皮髓質(zhì)可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)完整的腎小球、腎小管及其基底膜(圖6)。

2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

掃描電鏡觀察可見(jiàn)各組腎臟脫細(xì)胞支架皮髓質(zhì)部位細(xì)胞外基質(zhì)表面光滑，呈完整蜂窩狀結(jié)構(gòu)，Control組腎臟皮髓質(zhì)可見(jiàn)正常腎小球和腎小管(圖7)。

2.5 DNA含量測(cè)定

DNA定量結(jié)果顯示，Control組腎臟DNA含量為 (17 453.41±483.59) ng/mg，各組腎臟脫細(xì)胞支架DNA含量均<50 ng/mg，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8)。

2.6 腎臟脫細(xì)胞支架細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)

對(duì)離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架皮質(zhì)及髓質(zhì)部位的CollagenⅠ、Collagen Ⅳ、Fibronectin和Laminin進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，可見(jiàn)各組腎臟脫細(xì)胞支架和離體腎類似，CollagenⅠ、Collagen Ⅳ、Fibronectin和Laminin在細(xì)胞外基質(zhì)中有不同程度的表達(dá)(圖9)。

2.7 腎臟脫細(xì)胞支架體外細(xì)胞毒性

體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S組、TS組、FTS組未經(jīng)灌洗的腎臟脫細(xì)胞支架浸提液對(duì)細(xì)胞活力有明顯抑制作用，表明細(xì)胞毒性的Triton X-100和SDS在未灌洗支架中存在殘留。隨著S組、TS組、FTS組灌洗后腎臟脫細(xì)胞支架浸提液作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸下降(圖10)。按GB/T 16886.5-2003評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性為1級(jí)，可以認(rèn)為無(wú)細(xì)胞毒性。

圖3 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架HE染色觀察(A：腎皮質(zhì)部位HE染色觀察；B：腎髓質(zhì)部位HE染色觀察)

圖4 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架DAPI染色觀察(A：腎皮質(zhì)部位DAPI染色觀察；B：腎髓質(zhì)部位DAPI染色觀察)

圖5 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架Masson染色觀察(A：腎皮質(zhì)部位Masson染色觀察；B：腎髓質(zhì)部位Masson染色觀察)

圖6 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架PAS染色觀察(A：腎皮質(zhì)部位PAS染色觀察；B：腎髓質(zhì)部位PAS染色觀察)

圖7 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架掃描電鏡觀察(A：腎皮質(zhì)部位掃描電鏡觀察；B：腎髓質(zhì)部位掃描電鏡觀察)

圖8 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架DNA定量

2.8 腎臟脫細(xì)胞支架生長(zhǎng)因子濃度

ELISA檢測(cè)各組腎臟脫細(xì)胞支架的生長(zhǎng)因子濃度，在4 mL/min和10 mL/min流速下，F(xiàn)TS組的VEGF、EGF、IGF-1、PDGF-BB濃度均高于 S組、TS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FTS組內(nèi) 10 mL/min流速脫細(xì)胞后支架VEGF、EGF、IGF-1、PDGF-BB濃度高于4 mL/min組(圖11)。

3 討論

經(jīng)過(guò)多年的探索，目前組織工程支架材料的種類已十分豐富。其中，天然脫細(xì)胞支架材料已成功應(yīng)用在包括氣管[9-10]、心臟[11-12]、肝臟[13]和肺[14]在內(nèi)的各種組織器官的再生研究中。同時(shí)，腎臟脫細(xì)胞支架因其良好的理化特性及其在腎臟發(fā)育過(guò)程中起著調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[15]，近年來(lái)已成為腎臟組織工程研究的熱點(diǎn)之一。

圖9 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架細(xì)胞外基質(zhì)主要結(jié)構(gòu)蛋白免疫組織化學(xué)染色觀察(A：腎皮質(zhì)部位免疫組織化學(xué)染色觀察；B：腎髓質(zhì)部位免疫組織化學(xué)染色觀察)

圖10 體外檢測(cè)腎臟脫細(xì)胞支架細(xì)胞毒性結(jié)果

目前腎臟脫細(xì)胞支架的獲取多采用經(jīng)脈管系統(tǒng)整器官灌洗脫細(xì)胞劑以除去細(xì)胞成分。最常用的脫細(xì)胞劑包括Triton X-100和SDS。Triton X-100為非離子型洗脫劑，通過(guò)打破脂質(zhì)之間的連接破壞細(xì)胞膜。SDS為離子型洗脫劑，與Triton X-100相比，能夠更為有效地從致密的組織器官如腎臟中去除細(xì)胞核并保留組織結(jié)構(gòu)[15]。然而，濃度超過(guò)0.04%的SDS可以使細(xì)胞外基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)變性，并破壞細(xì)胞生長(zhǎng)所需的關(guān)鍵組分[16-17]。因此，在制備的脫細(xì)胞支架滿足其對(duì)移植受體低免疫原性要求的前提下，應(yīng)盡可能優(yōu)化脫細(xì)胞程序，減少脫細(xì)胞劑的濃度及灌注洗脫所需要的時(shí)間，從而最大化保留細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的含量、生理活性和空間結(jié)構(gòu)的完整性，以利于脫細(xì)胞支架的再細(xì)胞化。

圖11 離體腎和腎臟脫細(xì)胞支架生長(zhǎng)因子濃度(A：VEGF濃度；B：EGF濃度；C：IGF-1濃度；D：PDGF-BB濃度)

本研究在應(yīng)用低濃度Triton X-100和SDS脫細(xì)胞之前，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融，在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶破壞細(xì)胞膜溶解細(xì)胞，而不會(huì)影響支架材料的再細(xì)胞化[18]。此外，通過(guò)不同流速下脫細(xì)胞進(jìn)一步探究脫細(xì)胞劑灌注過(guò)程中液體流速對(duì)腎臟脫細(xì)胞支架的影響。在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，我們發(fā)現(xiàn)在20 mL/min流速下脫細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致腎臟脫細(xì)胞支架的破裂，因此設(shè)計(jì)了4 mL/min和10 mL/min兩組流速脫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與S組、TS組相比，F(xiàn)TS組脫細(xì)胞時(shí)間明顯縮短。10 mL/min流速脫細(xì)胞較 4 mL/min更快，提示在一定范圍內(nèi)較高的流速能夠提高脫細(xì)胞劑整器官脫細(xì)胞的效率。生物力學(xué)檢測(cè)顯示，10 mL/min組支架腎動(dòng)脈入口處脈管阻力低于4 mL/min組，推測(cè)可能與高流速灌洗條件下彈性的腎臟脫細(xì)胞支架脈管孔徑增大有關(guān)。流體分布測(cè)量顯示，經(jīng)腎動(dòng)脈灌注的液體從支架器官外壁溢出增加，提示腎臟脫細(xì)胞支架具有一定滲透性，這可能將影響細(xì)胞經(jīng)脈管灌注實(shí)現(xiàn)支架再細(xì)胞化過(guò)程中細(xì)胞的傳遞，而脫細(xì)胞方法及流速對(duì)流體分布無(wú)明顯影響。HE染色、DAPI染色和DNA定量提示各組腎臟脫細(xì)胞支架無(wú)細(xì)胞成分殘留，且各組制備的支架已經(jīng)達(dá)到脫細(xì)胞基質(zhì)生物相容性的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)[19]。腎臟細(xì)胞外基質(zhì)主要由糖胺聚糖、膠原(主要為Ⅰ和Ⅳ型)、Fibronectin和Laminin組成[20]。Masson染色顯示各組腎臟脫細(xì)胞支架中膠原的保留和結(jié)構(gòu)的完整。PAS染色顯示腎臟脫細(xì)胞支架中腎小球/管基底膜中多糖成分的保留及膜結(jié)構(gòu)的完整。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)各組腎臟脫細(xì)胞支架中仍然存在CollagenⅠ、CollagenⅣ、Fibronectin和Laminin的表達(dá)。此外，脫細(xì)胞支架的超微結(jié)構(gòu)將影響細(xì)胞在材料表面的遷移，干預(yù)細(xì)胞與支架材料的粘附行為[21]。掃描電鏡提示本實(shí)驗(yàn)各組腎臟脫細(xì)胞支架的細(xì)胞外基質(zhì)表面光滑，呈蜂窩狀排列，空間結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，利于細(xì)胞的傳遞與粘附。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)提示灌洗后的腎臟脫細(xì)胞支架無(wú)明顯細(xì)胞毒性，符合生物材料體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的安全標(biāo)準(zhǔn)。VEGF在腎內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，對(duì)維持細(xì)胞增殖和腎臟發(fā)育至關(guān)重要；EGF在近端小管增殖及腎器官發(fā)生中具有重要意義[22]。IGF-1通過(guò)刺激腎小管上皮細(xì)胞Na通道，在調(diào)節(jié)鈉鹽平衡中起重要作用[23]。PDGF-BB具有誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用[24]。ELISA檢測(cè)提示，F(xiàn)TS10組腎臟脫細(xì)胞支架VEGF、EGF、IGF-1、PDGF-BB濃度較其他各組高。這可能與FTS10組脫細(xì)胞劑，尤其是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)影響較大的SDS溶液作用時(shí)間明顯縮短有關(guān)。而同時(shí)，這一結(jié)果也提示FTS10組脫細(xì)胞程序能夠更好地保留細(xì)胞外基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子，從而為腎臟各種細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，為后期腎臟脫細(xì)胞支架的再細(xì)胞化打下了良好基礎(chǔ)。

隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)步和方法的創(chuàng)新，腎臟組織工程研究取得了巨大的進(jìn)步。但值得注意的是，由于腎臟本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、細(xì)胞表型的多樣性和生理功能的復(fù)雜性，實(shí)現(xiàn)腎臟組織器官的再生是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，凍融后聯(lián)合Triton X-100和SDS灌注可以成功制備腎臟脫細(xì)胞支架，該支架無(wú)細(xì)胞成分，有一定滲透性，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，為腎臟組織工程提供了理想的支架材料。與SDS灌注、Triton X-100聯(lián)合SDS灌注相比，該方法脫細(xì)胞效率更高，對(duì)支架中的膠原、基底膜、主要結(jié)構(gòu)蛋白及超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，能更好地保留細(xì)胞外基質(zhì)中的VEGF、EGF、IGF-1、PDGF-BB。10 mL/min流速脫細(xì)胞較4 mL/min能明顯提高脫細(xì)胞效率，且對(duì)支架空間結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。綜上，本研究探索優(yōu)化了腎臟脫細(xì)胞支架制備的有利條件，為組織工程構(gòu)建再生腎及腎臟體外病理、毒理研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Optimization of preparation of rat kidney decellularized scaffold by combining freeze-thawing with perfusion

Dong Hu, Deying Zhang, Bo Liu, Yu Zhou, Yihang Yu, Lianju Shen, Chunlan Long, Xing Liu, Tao Lin, Dawei He, and Guanghui Wei

Department of Urology, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Children Urogenital Development and Tissue Engineering, China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Chongqing 400014, China

We explored the improved method to prepare decellularized kidney scaffold and provide experimental basis for kidney tissue engineering and renal pathology and toxicologyresearch. We perfused rat kidneys with PBS (group control) and prepared the decellularized kidney scaffolds with sodium dodecyl sulfate (SDS) (group S), Triton X-100 combined with SDS (group TS), and Triton X-100 combined with SDS after repeated freezing and thawing (group FTS) in different flow velocity. Meanwhile we measured their fluid distributions and vascular resistance. We examined the degree of decellularization of acellular scaffolds by HE, DAPI staining and DNA quantification. We examined the retention of main composition and structural integrity of decellularized scaffolds by Masson, PAS and immunohistochemical staining. We also detected the ultrastructure, cytotoxicity and the level of growth factor of the scaffolds by scanning electron microscope, MTT and ELISA, respectively. The results showed that the time of decellularization in group FTS was less than that in group S and TS. The vascular resistance of scaffolds decellularized at 10 mL/min flow velocity was lower. The fluid distribution in groups S, TS and FTS was different from that in control group. No residual cell was detected by HE and DAPI staining. DNA content was less than 50 ng/mg. Masson, PAS and immunohistochemical staining results showed that there was extracellular collagen, polysaccharide, type I collagen, type IV collagen, fibronectin and laminin in the decellularized scaffolds, and the scanning electron microscope result showed the scaffolds had the honeycomb structure. The cytotoxicity level of decellularized scaffolds was between grade 0 to 1. The level of VEGF, EGF, IGF-1 and PDGF-BB in group FTS were significantly higher than those in group S and TS. In concluding,combining freeze-thawing with perfusion can produce more ideal and effective whole organ decellularized scaffold of rat kidney, and make a foundation for the study of kidney tissue engineering and in vitro pathology and toxicology of kidney.

tissue engineering, kidney, decellularized scaffolds, freeze-thawing, perfusion

July 1, 2018;

September 6, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 81771566，81800618), Entrepreneurship and Innovation Support Program for Returned Overseas Chinese Scholars, Chongqing (No. cx2017015).

Deying Zhang. Tel/Fax: +86-23-63633264; E-mail: dzdy199@126.com Guanghui Wei. E-mail: u806806@cqmu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81771566，81800618)，重慶市留學(xué)人員回國(guó)創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新支持計(jì)劃 (No. cx2017015) 資助。

2019-01-11

10.13345/j.cjb.180272

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190110.1115.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)