大腸桿菌利用葡萄糖和木糖合成乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯

笪央央，李微，史理隴，李正軍

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大腸桿菌利用葡萄糖和木糖合成乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯

笪央央，李微，史理隴，李正軍

北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

笪央央, 李微, 史理隴, 等. 大腸桿菌利用葡萄糖和木糖合成乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯.生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 254–262.Da YY, Li W, Shi LL, et al. Microbial production of poly (glycolate-co-lactate-co-3-hydroxybutyrate) from glucose and xylose by Escherichia coli. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 254–262.

以大腸桿菌為宿主，構(gòu)建了以葡萄糖和木糖為底物獲得乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯的生物合成途徑，包括過表達(dá)塔格糖-3-差向異構(gòu)酶、核酮糖激酶、醛縮酶、醛脫氫酶、丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶和聚合酶等。在此基礎(chǔ)上，表達(dá)聚羥基脂肪酸酯顆粒結(jié)合蛋白，提高了聚合物的合成，重組菌的細(xì)胞干重達(dá)到3.73 g/L，含有38.72 wt%的共聚酯。采用混菌共培養(yǎng)策略，實(shí)現(xiàn)以葡萄糖和木糖混合物為底物合成共聚酯，搖瓶實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞干重達(dá)到4.01 g/L，含有21.54 wt%的聚合物。文中提供了一種以葡萄糖和木糖混合物為碳源合成聚合物的方法，為下一步纖維素水解物的有效利用提供了參考。

聚羥基脂肪酸酯，乙醇酸，乳酸，3-羥基丁酸，葡萄糖，木糖

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoate，簡(jiǎn)稱PHA) 是一類由微生物在生長(zhǎng)代謝不平衡條件下合成的作為碳源和能源儲(chǔ)存物質(zhì)的高分子聚酯[1-2]。與傳統(tǒng)的石油來源的塑料材料相比，PHA具有生物可再生性和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)，引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。隨著代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新型PHA合成菌株被構(gòu)建出來，在提高聚合物產(chǎn)量、調(diào)控聚合物單體組成和比例、降低發(fā)酵成本等方面取得了良好的進(jìn)展[3-4]。目前，PHA材料的生產(chǎn)成本仍然高于石油來源的塑料材料，成為PHA材料大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的主要障礙。

葡萄糖是自然界中存在最為廣泛的單糖，是微生物發(fā)酵的主要碳源[5]。氨基酸和有機(jī)酸等大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)品以葡萄糖為底物進(jìn)行，存在“與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地”的難題。如果能以木質(zhì)纖維素為原料來獲得高附加值化學(xué)品，將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。木糖是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中含量?jī)H次于葡萄糖的單糖[6]，占木質(zhì)纖維素原料的18%–30%[7]。然而，木糖作為微生物的發(fā)酵原料仍是難點(diǎn)，缺少有效轉(zhuǎn)化木糖進(jìn)行化學(xué)品生產(chǎn)的工程菌株[8]。例如，傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株，包括釀酒酵母[9]和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌[10]等，都不能夠有效利用木糖。因此，開發(fā)高效利用木糖獲得生物基化學(xué)品和生物材料的工程菌株，實(shí)現(xiàn)木糖的高效轉(zhuǎn)化，是促進(jìn)木質(zhì)纖維素資源大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的重要因素。

大腸桿菌是現(xiàn)代生物學(xué)中研究最多的細(xì)菌，將其作為宿主進(jìn)行發(fā)酵具有許多優(yōu)勢(shì)，如遺傳背景清楚、生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)要求較低和底物利用范圍廣等。對(duì)大腸桿菌進(jìn)行代謝工程改造，可以獲得高級(jí)醇類[11-12]、多元醇[13]、短鏈烷烴[14]、琥珀酸[15]、葡糖二酸[16]和脂肪酸[17]等，部分產(chǎn)品已達(dá)較高發(fā)酵水平。在之前的研究工作中，我們利用大腸桿菌構(gòu)建了葡萄糖合成乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯poly(glycolate--lactate--3- hydroxybutyrate) [P(GA-LA-3HB)]的代謝途徑[18]。在此基礎(chǔ)上，文中構(gòu)建了以葡萄糖和木糖為底物合成P(GA-LA-3HB) 的生物合成途徑，并通過混菌共培養(yǎng)的方法實(shí)現(xiàn)兩種碳源的同時(shí)利用，為將來木質(zhì)纖維素水解物的有效利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

本研究使用的菌種和質(zhì)粒見表1。K12(DE3) 及其木酮糖激酶基因和乙醇酸氧化酶基因雙敲除突變體ΔΔ為實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pKD13、pKD46和pCP20由美國(guó)耶魯大學(xué)CGSC (The Coli Genetic Stock Center) 惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行，大腸桿菌合成聚合物的搖瓶實(shí)驗(yàn)在MMYE培養(yǎng)基中進(jìn)行。含有質(zhì)粒的重組菌株在培養(yǎng)時(shí)加入相應(yīng)的抗生素，濃度分別為氨芐青霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，氯霉素34 μg/mL，鹽酸大觀霉素50 μg/mL。

LB培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，pH 7.0。LB固體培養(yǎng)基額外添加15 g/L的瓊脂。

表1 本研究使用的菌種和質(zhì)粒

MMYE培養(yǎng)基：4 g/L酵母粉，2 g/L NH4Cl，5 g/L (NH4)2SO4，6 g/L KH2PO4，8.4 g/L3-嗎啉丙磺酸 (MOPS, C7H15NO4S)，0.5 g/L NaCl，0.24 g/L MgSO4，0.002 g/L Na2MoO4，1 mL/L 微量元素溶液。微量元素溶液包括：3.6 g/L FeCl2·4H2O，5 g/L CaCl2·2H2O，1.3 g/L MnCl2·2H2O，0.38 g/L CuCl2·2H2O，0.5 g/L CoCl2·6H2O，0.94 g/L ZnCl2，0.03 g/L H3BO3，0.4 g/L Na2EDTA·2H2O，1.01 g/Lthiamine-HCl。

1.3 主要試劑

Pusion High-Fidelity DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶等購于New England Biolabs公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA回收試劑盒購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；聚-3-羥基丁酸酯和聚乳酸-乙醇酸共聚酯標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma-Aldrich公司。其他抗生素、異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)、酵母粉和蛋白胨等試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.4 pET-pct-PCAB的構(gòu)建

對(duì)羅氏真養(yǎng)菌H16的PHA顆粒結(jié)合蛋白基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，基因全序列合成由無錫青蘭生物科技有限公司完成。人工合成的插入到質(zhì)粒pET-pct- CAB[18]的Ⅰ和Ⅰ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pET-pct- PCAB，含有T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的、、、和基因 (圖1)。

圖1 pET-pct-PCAB的質(zhì)粒圖譜

1.5 突變菌株的構(gòu)建

采用Red同源重組的方法在大腸桿菌中構(gòu)建基因缺失突變體[19]，基因敲除所需的引物見表2，引物合成和DNA測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

1.5.1 K12ΔΔΔ的構(gòu)建

以質(zhì)粒pKD13為模板，ptsF和ptsR為引物，PCR擴(kuò)增約1.5 kb的含有卡那霉素抗性基因的DNA片段，純化之后，電擊轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pKD46的K12 ΔΔ感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑單克隆進(jìn)行菌落PCR和DNA測(cè)序鑒定，得到含有卡那霉素抗性的丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因缺失突變體。

將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化到上述突變體中，涂布含有氯霉素的LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，消除卡那霉素抗性；挑單克隆轉(zhuǎn)接到無抗的LB平板，42 ℃培養(yǎng)24 h，丟失pCP20質(zhì)粒；最后驗(yàn)證菌株的抗性，選擇沒有氯霉素、卡那霉素和氨芐青霉素抗性的菌株進(jìn)行菌落PCR和DNA測(cè)序鑒定，獲得最終的缺失突變體K12ΔΔΔ。

表2 基因敲除所需的引物

1.5.2 K12ΔΔΔ的構(gòu)建

以K12ΔΔ為初始菌株，木糖異構(gòu)酶基因的敲除與的敲除采用同樣的方法進(jìn)行。

1.5.3 K12ΔΔΔ的構(gòu)建

以K12ΔΔ為初始菌株，乳酸脫氫酶基因的敲除與的敲除采用同樣的方法進(jìn)行。

1.6 聚合物合成的搖瓶培養(yǎng)

1.6.1 單菌培養(yǎng)

質(zhì)粒pET-pct-CAB[18]和含有木糖合成乙醇酸相關(guān)基因的質(zhì)粒pGAx3[20]共轉(zhuǎn)化到K12 ΔΔ中，構(gòu)建重組菌PGA21。質(zhì)粒pET-pct-PCAB和pGAx3共轉(zhuǎn)化到K12 ΔΔ中，構(gòu)建重組菌PGA22。質(zhì)粒pET-pct-PCAB和pGAx3共轉(zhuǎn)化到K12 ΔΔΔ中，構(gòu)建重組菌PGA23。

從凍存管中取出菌種PGA21、PGA22和PGA23，接種到LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h作為種子液。3種菌分別以2% (/) 的接種量轉(zhuǎn)接到含有25 mL MMYE+5 g/L木糖培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃培養(yǎng)18 h后，添加葡萄糖至終濃度20 g/L，添加IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)54 h。

1.6.2 混菌培養(yǎng)

質(zhì)粒pGAx3電擊轉(zhuǎn)化到K12 ΔΔΔ中，構(gòu)建重組菌PGA24。質(zhì)粒pET-pct- PCAB電擊轉(zhuǎn)化到K12 ΔΔΔ中，構(gòu)建重組菌PGA25。

從凍存管中取出菌種PGA24和PGA25，接種到LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h作為種子液。以1% (/) 的接種量一起轉(zhuǎn)接到含有25 mL MMYE+ 5 g/L木糖+20 g/L葡萄糖培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，添加IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)60 h。

1.7 分析方法

搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，8 000 r/min離心10 min收集菌體，然后用去離子水洗滌、離心，去掉菌體表面粘附的培養(yǎng)基成分。將得到的細(xì)胞在抽真空條件下冰凍干燥至恒重，測(cè)定細(xì)胞干重 (Cell dry weight，CDW)。

取50 mg左右干細(xì)胞于酯化管中，加入2 mL酯化液 (含有2 g/L苯甲酸、3% (/) 濃硫酸的色譜純甲醇溶液) 和2 mL 氯仿，加蓋密閉。100 ℃酯化反應(yīng)4 h。冷卻至室溫后，加入1 mL去離子水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水相完全分離后，取氯仿相進(jìn)行氣相色譜 (Gas chromatography，GC) 分析。使用HP 6890型氣相色譜儀和HP-5毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度220 ℃。柱溫從80 ℃開始，停留1.5 min；以30 ℃/min的速率升溫到140 ℃，停留0 min；再以40 ℃/min的速率升溫到220 ℃，停留0.5 min。聚合物標(biāo)品采用同樣的方法進(jìn)行，利用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算干細(xì)胞中聚合物的組成和含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建P(GA-LA-3HB) 合成途徑

以葡萄糖和木糖為聯(lián)合碳源，設(shè)計(jì)乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯P(GA-LA-3HB)的生物合成途徑。如圖2所示，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶LdhA催化下生成乳酸，表達(dá)輔酶A轉(zhuǎn)移酶Pct，使乳酸轉(zhuǎn)化為乳酰CoA，作為乳酸聚合的前體。表達(dá)β-酮硫解酶PhaA和乙酰乙酰輔酶A還原酶PhaB，使乙酰輔酶A生成3-羥基丁酰輔酶A，作為3-羥基丁酸聚合的前體。木糖在木糖異構(gòu)酶XylA、塔格糖-3-差向異構(gòu)酶Dte、核酮糖激酶FucK、醛縮酶FucA和醛脫氫酶AldA的催化下生成乙醇酸，再表達(dá)輔酶A轉(zhuǎn)移酶Pct，使乙醇酸轉(zhuǎn)化為乙醇酰CoA，作為乙醇酸聚合的前體。最后，表達(dá)PHA聚合酶PhaC，催化乙醇酰輔酶A、乳酰輔酶A和3-羥基丁酰輔酶A的聚合反應(yīng)，獲得含有乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸3種單體組分的聚合物。

圖2 葡萄糖和木糖合成P(GA-LA-3HB) 的代謝途徑

構(gòu)建大腸桿菌PGA21，過表達(dá)、、、、、、和基因。按照1.6.1 所述的方法進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)重組菌的細(xì)胞生長(zhǎng)和聚合物合成情況。結(jié)果表明，PGA21的細(xì)胞干重達(dá)2.58 g/L，含有10.44 wt%的P(21.75 mol% GA-14.21 mol% LA-3HB)。這說明設(shè)計(jì)的共聚酯合成途徑能夠在大腸桿菌中成功表達(dá)。重組菌首先利用木糖合成乙醇酸單體，接下來利用葡萄糖合成P(GA-LA-3HB) 聚合物，但共聚酯的含量較低，僅為細(xì)胞干重的10%左右。

2.2 PHA顆粒結(jié)合蛋白表達(dá)對(duì)共聚酯合成的影響

細(xì)胞內(nèi)合成的聚羥基脂肪酸酯以不溶于水的顆粒形式存在，其表面除存在PHA聚合酶外，還有一類雙親性的PHA顆粒結(jié)合蛋白，能夠阻止不同PHA顆粒之間的融合，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)PHA顆粒的大小和比表面積[21]。羅氏真養(yǎng)菌H16的PhaP1是研究最為清楚的PHA顆粒結(jié)合蛋白[22]，其編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，在大腸桿菌中異源表達(dá)。構(gòu)建重組菌PGA22，研究PHA顆粒結(jié)合蛋白過表達(dá)對(duì)P(GA-LA-3HB) 合成的影響。如圖3A和圖3B所示，PGA22的細(xì)胞干重達(dá)3.73 g/L，含有38.72 wt% 的P(22.69 mol% GA-8.88 mol% LA-3HB)。過表達(dá)PhaP1明顯提高了細(xì)胞干重和聚合物含量，與對(duì)照菌PGA21相比，PGA22中P(GA-LA-3HB) 產(chǎn)量由0.27 g/L提高到1.44 g/L。de Almeida等[23]和Zhou等[24]分別報(bào)道了PHA顆粒結(jié)合蛋白對(duì)聚-3-羥基丁酸酯和聚4-羥基丁酸酯合成的促進(jìn)作用，所使用的PhaP和聚合酶PhaC均來自于相同的菌株。本研究所使用的聚合酶PhaC來自于假單胞菌，這說明H16的PhaP1對(duì)異源聚合酶催化的PHA合成也有促進(jìn)作用。

圖3 大腸桿菌PGA22和PGA23合成P(GA-LA-3HB)的搖瓶實(shí)驗(yàn)

2.3 ldhA基因敲除對(duì)共聚酯合成的影響

乳酸脫氫酶基因在大腸桿菌中負(fù)責(zé)催化丙酮酸還原為乳酸。對(duì)基因進(jìn)行敲除，研究其缺失對(duì)P(GA-LA-3HB) 合成的影響。如圖3C和圖3D所示，與對(duì)照菌PGA22相比，基因敲除菌PGA23的細(xì)胞干重和聚合物含量都有明顯降低，細(xì)胞干重從3.73 g/L下降到2.30 g/L，聚合物含量從38.72 wt%下降到7.49 wt%。雖然PGA23中的乳酸脫氫酶基因被敲除，但所得聚合物中仍然檢測(cè)到少量乳酸單體。有研究表明，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)存在甲基乙二醛循環(huán)，能以糖酵解中間體磷酸二羥丙酮為前體合成少量乳酸[25]?；蛉笔?dǎo)致了聚合物產(chǎn)量下降，提示乳酸單體的存在有利于P(GA-LA-3HB)的合成。

2.4 混菌共培養(yǎng)合成P(GA-LA-3HB)

由于碳代謝物阻遏 (Carbon catabolite repression，CCR) 效應(yīng)，大腸桿菌在含有葡萄糖和木糖的混合碳源中，首先利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖耗盡后才能夠代謝木糖[26-27]。因此，在單菌搖瓶培養(yǎng)中，首先向培養(yǎng)基中加入木糖，分解產(chǎn)生乙醇酸單體，再加入葡萄糖來合成聚合物。在木質(zhì)纖維素水解液中，葡萄糖和木糖是同時(shí)存在的。為了達(dá)到兩者的同時(shí)利用，采用了混菌共培養(yǎng)的方法。

圖4 構(gòu)建同時(shí)利用葡萄糖和木糖的混菌培養(yǎng)體系

構(gòu)建磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因缺失的突變體K12 ΔΔΔ，該突變體在含有葡萄糖和木糖混合碳源的基本培養(yǎng)基中，只能利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)，但葡萄糖代謝速度變慢 (圖4A)。轉(zhuǎn)入木糖合成乙醇酸相關(guān)基因所得重組菌PGA24在葡萄糖和木糖同時(shí)存在的條件下，首先利用木糖生產(chǎn)乙醇酸，隨后開始代謝葡萄糖 (圖4B)。構(gòu)建木糖異構(gòu)酶基因缺失的突變體K12 ΔΔΔ，該突變體在含有葡萄糖和木糖混合碳源的基本培養(yǎng)基中，只能利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng) (圖4C)。轉(zhuǎn)入聚合物合成基因，構(gòu)建重組菌PGA25。在葡萄糖和木糖混合物中，PGA24首先利用木糖，PGA25只能利用葡萄糖，將PGA24和PGA25混合共培養(yǎng)，兩種碳源可以同時(shí)被消耗 (圖4D)。

進(jìn)行混菌共培養(yǎng)合成P(GA-LA-3HB)的搖瓶實(shí)驗(yàn)，將PGA24和PGA25混合共培養(yǎng)在含有葡萄糖和木糖的MMYE培養(yǎng)基中，獲得了4.01 g/L的細(xì)胞干重，含有21.54 wt%的P(2.81 mol% GA-2.82 mol% LA-3HB) (圖5A, 5B)。這說明，混菌共培養(yǎng)能夠在含有葡萄糖和木糖混合物的培養(yǎng)基中獲得共聚酯，但聚合物中乙醇酸和乳酸單體的比例較低，3-羥基丁酸單體的比例超過90 mol%。后續(xù)研究中，進(jìn)一步調(diào)控PGA24和PGA25的接種比例，有可能獲得單體含量多樣的P(GA-LA-3HB)共聚酯材料。

圖5 大腸桿菌混菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化葡萄糖和木糖混合物合成P(GA-LA-3HB)

3 結(jié)論

本研究通過在大腸桿菌中表達(dá)塔格糖-3-差向異構(gòu)酶、核酮糖激酶、醛縮酶、醛脫氫酶、丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶和聚合酶，成功構(gòu)建了葡萄糖和木糖為碳源合成乙醇酸、乳酸和3-羥基丁酸共聚酯的生物合成途徑。在此基礎(chǔ)上，表達(dá)聚羥基脂肪酸酯顆粒結(jié)合蛋白，明顯提高了聚合物的合成。

對(duì)大腸桿菌的糖代謝途徑進(jìn)行改造，獲得在葡萄糖和木糖混合物中僅能利用葡萄糖或者木糖的突變體。將兩種突變體混合培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)利用葡萄糖和木糖混合物合成聚合物，為將來纖維素水解物的有效利用提供了參考。

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Microbial production of poly (glycolate--lactate--3- hydroxybutyrate) from glucose and xylose by

Yangyang Da, Wei Li, Lilong Shi, and Zhengjun Li

College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

was metabolically engineered to produce poly(glycolate--lactate--3-hydroxybutyrate) using glucose and xylose as carbon sources. The combinatorial biosynthetic route was constructed by the overexpression of a series of enzymes including D-tagatose 3-epimerase, L-fuculokinase, L-fuculose-phosphate aldolase, aldehyde dehydrogenase, propionyl-CoA transferase, β-ketothiolase, acetoacetyl-CoA reductase, and polyhydroxyalkanoate synthase. Overexpression of polyhydroxyalkanoate granule associated protein significantly improved biopolymer synthesis, and the recombinant strain reached 3.73 g/L cell dry weight with 38.72% (/) biopolymer content. A co-culture engineering strategy was developed to produce biopolymer from a mixture of glucose and xylose, achieving 4.01 g/L cell dry weight containing 21.54% (/) biopolymer. The results of this work offer an approach for simultaneously utilizing glucose and xylose and indicate the potential for future biopolymer production from lignocellulosic biomass.

polyhydroxyalkanoate, glycolate, lactate, 3-hydroxybutyrate, glucose, xylose

May 11, 2018;

July 26, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 21476014),Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program of China (No. 2015BAD15B09).

Zhengjun Li. Tel: +86-10-64421335; Fax: +86-10-64416428; E-mail: lizj@mail.buct.edu.cn

10.13345/j.cjb.180199

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 21476014)，國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No. 2015BAD15B09) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)