芹菜素對(duì)腺嘌呤所致慢性腎功能衰竭大鼠腎保護(hù)作用及機(jī)制探索*

楊 杰 胡亞麗 楊曉媛

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

慢性腎功能衰竭（CRF）是各種慢性腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)局，呈進(jìn)行性加重且不可逆，具有預(yù)后差、死亡率高的特點(diǎn)［1-2］。目前臨床上尚缺乏有效的治療措施，一直是醫(yī)藥研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。CRF病理機(jī)制非常復(fù)雜，近年來(lái)病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等在CRF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［3-4］，為研究新型抗CRF藥物研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。芹菜素（APG）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的天然存在的黃酮類(lèi)化合物，在多種水果蔬菜中均含量豐富，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)APG具有良好的抗氧化和抑制炎癥反應(yīng)的生物學(xué)活性［5-7］，但APG是否對(duì)CRF具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)復(fù)制CRF模型大鼠并腹腔注射給予APG進(jìn)行治療，通過(guò)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)并對(duì)比正常對(duì)照組、CRF模型組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，探討APG對(duì)CRF大鼠腎臟組織的保護(hù)作用并探索其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）雄性SD大鼠 （8周齡，220～260 g）購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（冀）2013-1-003］。 飼養(yǎng)環(huán)境：23～25 ℃、相對(duì)濕度 55%～60%，光照周期明∶暗為 12 h∶12 h。

1.2 試藥與儀器 APG購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司（批號(hào) 170329）；腎功能指標(biāo)［血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿素（UA）、24 h 尿蛋白（Pro）］檢測(cè)試劑盒和炎癥因子指標(biāo)［C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（sICAM-1）、血管間黏附分子-1（VCAM-1）］檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；氧化應(yīng)激監(jiān)測(cè)指標(biāo)［超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPPs）、總抗氧化能力（T-AOC）］ 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。BS-200型全自動(dòng)生化分析儀 （深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；CUT4062型石蠟切片機(jī)（德國(guó)SLEE公司）；iMark型酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-Rad公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；臺(tái)式離心機(jī)（深圳市賽泰克生物科技有限公司）。

1.3 分組與造模 取100只實(shí)驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、APG低劑量組［10 mg/（kg·d）］、APG 中劑量組［20 mg/（kg·d）］、APG 高劑量組［40 mg/（kg·d）］組，每組 20 只。 復(fù)制CRF大鼠模型［8］：制備25%腺嘌呤溶液，連續(xù)灌胃21 d［250 mg/（kg·d）］以制備 CRF 大鼠模型。 造模結(jié)局判斷［9］：SCr水平高于正常高值，腎臟組織呈現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)纖維化等病理性改變，即造模成功。

1.4 干預(yù)方法 準(zhǔn)確稱(chēng)量APG并加入適量0.9%氯化鈉注射液，以配置濃度為20 mg/mL的APG溶液，然后依次稀釋配置濃度為10 mg/mL、5 mg/mL的APG溶液。造模完成后，APG低、中、高劑量組分別腹腔注射給予濃度為 5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的APG溶液（2 mL/kg）［10-11］，每日 1 次，療程 28 d；正常對(duì)照組和模型組同步腹腔注射給予等體積的0.9%氯化鈉注射液（2 mL/kg）。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 療程結(jié)束后，腹腔注射烏拉坦實(shí)施麻醉，開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，不做抗凝處理，靜置1 h，4℃低溫1 500 r/min離心10 min取血清，血液標(biāo)本均-20℃保存待檢。取血完成后，摘取兩側(cè)腎臟組織，分別用于稱(chēng)質(zhì)量、計(jì)算腎臟指數(shù)，病理學(xué)檢查和腎臟組織生化指標(biāo)檢測(cè)。1）腎功能指標(biāo)檢測(cè)：治療滿(mǎn)療程后，收集24 h尿量并測(cè)定Pro；通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中BUN、SCr、UA含量。2）稱(chēng)量體質(zhì)量、腎臟重量并計(jì)算腎臟指數(shù)。稱(chēng)量體質(zhì)量和左側(cè)腎臟質(zhì)量。計(jì)算公式：腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟重量/體質(zhì)量。3）組織病理學(xué)檢查及評(píng)分：取稱(chēng)質(zhì)量后左側(cè)腎臟組織，置4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，72 h后進(jìn)行石蠟包埋和切片，脫蠟水化處理后行常規(guī)HE染色 （依次進(jìn)行酒精梯度脫蠟、PBS洗滌、蘇木素染色5 min、0.5%酒精鹽酸分色、尹紅染色20 s、封片等步驟），通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)。 對(duì)腎臟組織病變進(jìn)行評(píng)分［12］：（1）腎小球病變?cè)u(píng)分。0分為結(jié)構(gòu)正常；1分為少數(shù)腎小球變大或縮?。?分為部分腎小球變大或縮?。?分為大多數(shù)腎小球變大或縮小，或出現(xiàn)玻璃樣變。（2）腎小管病變。0分為結(jié)構(gòu)正常；1分為少量近曲小管細(xì)胞空泡變性；2分為部分近曲小管細(xì)胞空泡變性；3分為大量近曲小管細(xì)胞空泡變性。（3）腎間質(zhì)病變。0分：結(jié)構(gòu)正常。1分：腎小管輕度萎縮。2分：腎小管中度萎縮。3分：腎小管重度萎縮。（4）炎性病變。0分為結(jié)構(gòu)正常；1分為小灶狀炎癥；2分為片狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別腎小管壞死；3分為大片炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量腎組織壞死。病變積分=∑各部位病變?cè)u(píng)分。4）氧化應(yīng)激監(jiān)測(cè)指標(biāo)測(cè)定：取右側(cè)腎臟組織經(jīng)冷裂解液裂解、勻漿和低溫3 000 r/min離心10 min處理后，取上清液，遵照各試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定抗氧化酶SOD、CAT活性和MDA含量；采用化學(xué)比色法，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定血清中T-AOC和AOPPs水平。5）炎癥細(xì)胞因子測(cè)定：遵照各試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定血清中 CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1 含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腎功能指標(biāo)檢測(cè)比較 見(jiàn)表1。模型組大鼠血清BUN、SCr、UA含量和Pro較正常對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01）；較模型組，治療 28 d后 APG中、高劑量組CRF大鼠血清BUN、SCr、UA含量和Pro均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（x±s）

2.2 各組體質(zhì)量、左側(cè)腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)比較 見(jiàn)表2。模型組大鼠體質(zhì)量較正常對(duì)照組顯著降低且左側(cè)腎臟質(zhì)量、腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；較模型組，APG高劑量組治療28 d后CRF大鼠體質(zhì)量升高 （P＜0.05），APG中、高劑量組左側(cè)腎臟質(zhì)量、腎臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組體質(zhì)量、左側(cè)腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)比較（x±s）

2.3 各組腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果比較 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均未見(jiàn)異常；與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織呈現(xiàn)明顯的病理性改變，主要表現(xiàn)為腎小球數(shù)量減少、球囊粘連、囊腔擴(kuò)大，腎小管壞死、大量炎癥細(xì)胞出現(xiàn)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等；較模型組，APG中、高劑量組治療28 d后CRF大鼠腎臟組織病變明顯改善，改善效果以高劑量組最為顯著。計(jì)算并統(tǒng)計(jì)分析各組大鼠腎臟組織病變?cè)u(píng)分：模型組大鼠腎臟組織病變?cè)u(píng)分（9.45±0.61）分，較正常對(duì)照組（0.68±0.27）分顯著升高（P＜0.01）。APG低、中、高劑量組腎臟組織病變?cè)u(píng)分分別為（8.26±0.80）分、（6.69±0.57）分、（5.94±0.52）分，較模型組，APG 中、高劑量組治療28 d后CRF大鼠腎臟組織病變?cè)u(píng)分顯著降低（P＜0.01）。

圖1 腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，400倍）

2.4 各組腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見(jiàn)表3。模型組大鼠腎臟組織抗氧化酶SOD、CAT活性較正常對(duì)照組顯著降低且MDA含量升高（P＜0.01）；較模型組，APG中、高劑量組治療28 d后CRF大鼠腎臟組織SOD、CAT活性顯著提高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（x±s）

2.5 各組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見(jiàn)表4。模型組大鼠AOPPs水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），T-AOC水平顯著降低（P＜0.01）；較模型組，APG中、高劑量組治療28 d后CRF大鼠血清AOPPs水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高劑量組T-AOC水平顯著升高（P＜0.05）。

表4 各組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（x±s）

2.6 各組炎癥細(xì)胞因子含量比較 見(jiàn)表5。模型組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子 CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；較模型組，APG 中、高劑量組 CRP、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高劑量組IL-1含量降低（P＜0.01）。

表5 各組炎癥細(xì)胞因子含量比較（x±s）

3 討 論

流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)CRF發(fā)病率達(dá)568/100萬(wàn)，具有不可逆及持續(xù)進(jìn)展的特點(diǎn)，是主要致死原因之一［13］，是臨床上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一。高濃度腺嘌呤持續(xù)攝入是常用的CRF大鼠模型造模方法［9］，該方法制作的CRF大鼠模型與人類(lèi)接近。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組、模型組和芹菜素（APG）低劑量組［10 mg/（kg·d）］、中劑量組［20 mg/（kg·d）］和高劑量組［40 mg/（kg·d）］，因CRF判定指標(biāo)較為明確且本實(shí)驗(yàn)旨在考察APG對(duì)CRF的影響并探討其可能的機(jī)制，因此未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，不會(huì)對(duì)結(jié)論造成影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)APG治療28 d能夠有效減少CRF大鼠排尿量并降低24 h尿量和Pro，降低血清BUN、SCr、UA含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，降低腎臟指數(shù)，并且各組CRF大鼠各監(jiān)測(cè)指標(biāo)改善程度與APG給藥劑量具有相關(guān)性，提示APG對(duì)CRF大鼠腎臟損傷和腎功能具有一定的劑量依賴(lài)性保護(hù)作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等在CRF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［3-4］?；钚匝踝杂苫≧OS）代謝失衡而蓄積是引發(fā)氧化應(yīng)激損傷的主要原因，其與抗氧化酶活性降低密切相關(guān)。腎臟組織含有豐富的抗氧化酶SOD和CAT，二者活性降低將導(dǎo)致腎臟組織內(nèi)ROS的大量蓄積而引發(fā)腎臟組織過(guò)氧化損傷，MDA即為過(guò)氧化產(chǎn)物［14］。血清T-AOC水平能夠反應(yīng)機(jī)體整體抗氧化能力；血清中AOPPs是一種氧化修飾蛋白，是常用的氧化應(yīng)激標(biāo)志物［15］，并且Witko-Sarat V等［16］研究發(fā)現(xiàn)AOPPs能夠介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 是常用的機(jī)體炎癥監(jiān)測(cè)指標(biāo)，此外王興紅等研究發(fā)現(xiàn)血清sICAM-1、VCAM-1含量水平與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)［17］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG治療28 d能夠有效提高CRF大鼠腎臟組織SOD、CAT活性并降低MDA含量，提高血清T-AOC水平并降低AOPPs水平，降低CRF大鼠血清炎癥細(xì)胞因子 CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1 含量，APG高劑量組各指標(biāo)改善程度優(yōu)于APG中、低劑量組。結(jié)果提示APG具有抑制CRF大鼠氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的藥理學(xué)作用，且該藥理作用具有一定的劑量依賴(lài)性。

綜上所述，APG對(duì)CRF大鼠腎組織具有一定的劑量依賴(lài)性保護(hù)作用，APG降低氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥反應(yīng)可能是該作用的機(jī)制。