香根草對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制及其成分分析

潘 琦，劉婭琴，鄒國(guó)燕，周文宗，付子軾，劉長(zhǎng)娥，宋祥甫

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海201403)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量廢水和生活污水排入湖泊和江河，引起地表水體嚴(yán)重污染。富營(yíng)養(yǎng)化水域日益增多，導(dǎo)致藻類(lèi)特別是藍(lán)藻迅猛生長(zhǎng)，由此引發(fā)的水華或赤潮，在破壞原有水體生態(tài)系統(tǒng)平衡[1]的同時(shí)，也嚴(yán)重威脅到了人類(lèi)健康。改善富營(yíng)養(yǎng)化水體水質(zhì)，有效控制有害藻類(lèi)生長(zhǎng)已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有抑藻方法一般分為化學(xué)法、物理法和生物法[2]。但這些方法存在可能形成二次污染、見(jiàn)效慢等缺點(diǎn)，使其推廣受到限制[3-4]。因此，迫切需要尋求更加高效安全的抑藻技術(shù)。利用植物的化感作用抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)，為控制水華提供了新的研究思路。

植物化感作用抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)以其效率高、生態(tài)安全性好等特點(diǎn)而備受關(guān)注[5-7]?；凶饔檬侵敢环N植物通過(guò)向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)或抑制其他植物生長(zhǎng)的現(xiàn)象。目前，已發(fā)現(xiàn)多種水生植物具有化感作用，這些植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，通過(guò)多種方式抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。如粉綠狐尾藻可破壞集胞藻的葉綠素a和藻膽蛋白的特征吸收峰，降低藻細(xì)胞對(duì)光的吸收能力；蘆葦?shù)幕形镔|(zhì)EMA能造成藻類(lèi)細(xì)胞膜的徹底破壞，使K+、Ca2+、Mg2+外泄，從而使藻細(xì)胞死亡[8]。在已發(fā)現(xiàn)的植物化感物質(zhì)中，脂肪酸和酚類(lèi)化合物較為常見(jiàn)。張庭廷等[9]從普生輪藻中分離得到的3種脂肪酸(亞油酸、軟脂酸和豆蔻酸)，均有不同程度的抑藻作用。Gross等[10]發(fā)現(xiàn)，狐尾藻除脂肪酸外，其多酚類(lèi)物質(zhì)也具有抑藻活性；此外，萜類(lèi)和酯類(lèi)等也被證實(shí)具有較好的抑藻效果[11-12]。

香根草為禾本科香根草屬多年生植物，其根系能富集重金屬、吸收水體氮磷[12-14]，具有生長(zhǎng)速度快、凈化水質(zhì)能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種凈化富營(yíng)養(yǎng)化水體的理想植物。本研究以香根草作為供試植物，探討其對(duì)藍(lán)藻水華的主要組成者——銅綠微囊藻的抑制效果，并對(duì)其根系分泌物中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，以期為利用陸生植物控制有害藻類(lèi)的生長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為香根草(VetiveriazizanioidsLinn.)，供試藻類(lèi)為藍(lán)藻門(mén)的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，藻種來(lái)自上海師范大學(xué)。采用Modified C(CB)[15]營(yíng)養(yǎng)液作為藻類(lèi)試驗(yàn)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度為25℃，光暗比為14 h∶10h，由冷白熒光燈提供光照，光照強(qiáng)度為3 000 lx。

1.2 試驗(yàn)方法

香根草在塑料大棚內(nèi)陸地育苗后，選擇同期同齡的香根草2株(二者質(zhì)量平均值為820 g)。將其根系用蒸餾水洗凈，分別置于盛有10 L蒸餾水的塑料桶內(nèi)培養(yǎng)5 d，之后從塑料桶中分別收集1 L種植液，并進(jìn)行充分混合。香根草生長(zhǎng)情況如表1所示。

表1 試驗(yàn)所用香根草生長(zhǎng)情況

1.3 樣品采集及分析方法

1.3.1 樣品采集

種植水樣品：香根草種植水過(guò)濾后，用HCl調(diào)至pH 1.5，取150 mL用Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)行固相萃取。 萃取前先用4 mL甲醇活化萃取柱，再用4 mL蒸餾水(用HCl調(diào)pH至1.5)清洗，香根草種植水以3 mL/min的速度過(guò)柱，用pH 1.5的蒸餾水洗柱。 待水完全抽干后，用20 mL甲醇洗脫柱子上的提取物。 洗脫液用無(wú)水硫酸鈉脫水，R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL，作為香根草種植水樣品。

種植水與藻類(lèi)培養(yǎng)：香根草種植水經(jīng)Waterman玻璃纖維濾膜(GF/F 47 mm，孔徑0.52 μm)過(guò)濾后，取100 mL過(guò)濾液并添加CB營(yíng)養(yǎng)液使之與藻類(lèi)培養(yǎng)液濃度相同。在無(wú)菌條件下使用Millex-GP針頭過(guò)濾器抽濾滅菌。取滅菌后的種植水10 mL，接種100 μL的銅綠微囊藻液(試驗(yàn)初期銅綠微囊藻密度為1×104個(gè)/mL)，加塞后搖勻。取10 mL經(jīng)滅菌的CB培養(yǎng)液并接種100 μL的銅綠微囊藻液作為對(duì)照組。接種微囊藻的種植水和對(duì)照處理均各重復(fù)3次。上述操作均在無(wú)菌條件下完成。將錐形瓶置于25 ℃、3 000 lx、80 r/min的光照振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 測(cè)定方法

每3 d使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算藻細(xì)胞密度，記錄1次接種微囊藻的種植水和對(duì)照處理下的藻類(lèi)數(shù)量；銅綠微囊藻的葉綠素a采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

香根草種植水對(duì)藻類(lèi)的抑制率(RI)：RI=(1-N/N0)×100%。其中，N為香根草種植水組藻密度，105個(gè)/mL；N0為對(duì)照組藻密度，105個(gè)/mL。

取香根草種植水樣品2 mL，于45 ℃下氮?dú)獯蹈珊?，加?00 μL硅烷化試劑(BSTFA)和200 μL正己烷，封管后于120 ℃下反應(yīng)0.5 h，取1.0 μL該反應(yīng)液經(jīng)GC-MS(安捷倫5975C，美國(guó))對(duì)其化合物組成進(jìn)行分析。GC-MS測(cè)定條件：檢測(cè)儀器為Finnigan Voyager氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，質(zhì)量掃描范圍35—290原子質(zhì)量單位(amu)，色譜柱為VF-5 ms石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30 m×內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm)；接口溫度28 ℃，柱溫為80 ℃，保持2 min，以20 ℃/min的速率升至300 ℃，保持10 min，汽化溫度為250 ℃；載氣為He，流量為1.0 mL/min；分流比為20∶1；進(jìn)樣量為1.0 μL[16]。

質(zhì)譜檢測(cè)器：EI源，電子能量70 eV，源溫200 ℃，得到分離后的總離子流圖和各組分質(zhì)譜圖。使用 NIST 譜庫(kù)進(jìn)行圖譜檢索，并使用面積歸一化法計(jì)算各種物質(zhì)的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

將添加CB營(yíng)養(yǎng)液的香根草種植水以及對(duì)照組分別與藻類(lèi)培養(yǎng)21 d后發(fā)現(xiàn)，2種培養(yǎng)液中銅綠微囊藻均有不同程度的生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，香根草種植水與藻類(lèi)培養(yǎng)中的銅綠微囊藻生長(zhǎng)緩慢。香根草種植水與銅綠微囊藻共培養(yǎng)6 d后，香根草種植水開(kāi)始對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間的推移而增加；共培養(yǎng)15d后，種植水對(duì)藻類(lèi)的抑制作用開(kāi)始下降，其對(duì)銅綠微囊藻的抑制率最高可達(dá)到76%(圖1)。

圖1 香根草種植水對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of root exudates solution of V.zizanioids on growth of M.aeruginosa

使用種植水進(jìn)行試驗(yàn)，可以避免種植的香根草與藻類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)光照、營(yíng)養(yǎng)和空間等因素對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響，從而體現(xiàn)香根草對(duì)藻類(lèi)作用的試驗(yàn)?zāi)康?。種植水添加CB營(yíng)養(yǎng)液后，用NaOH調(diào)節(jié)種植水的pH至8，以避免香根草根系分泌物的有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)可能會(huì)降低水的pH，進(jìn)而影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)。由此證實(shí)香根草對(duì)藻類(lèi)的抑制作用是其所釋放的化感物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞的生理影響。

葉綠素a是反映藻類(lèi)是否正常生長(zhǎng)和光合作用的重要指標(biāo)之一。在本試驗(yàn)中銅綠微囊藻在香根草種植水中培養(yǎng)21d后，種植水中藻類(lèi)葉綠素a含量為 447.62mg/L，對(duì)照組銅綠微囊藻葉綠素a含量則高達(dá)3 592mg/L，對(duì)照組銅綠微囊藻葉綠素含量是香根草種植水的8倍，差異極顯著(P<0.01)。

蒸餾水培養(yǎng)5d后收集到的香根草種植水和根系提取物的樣品，經(jīng)GC-MS分析(圖2)，香根草種植水中的成分主要為脂肪酸。通過(guò)與NIST譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行匹配，篩選得到一些匹配度較高的化合物。表2顯示，從香根草種植水中共鑒定出 24 種化合組分，其中2-羥基丙酸相對(duì)含量最高，為 50.71%；其次是棕櫚酸，相對(duì)含量為 23.2%。

圖2 香根草種植水和根系提取物 GC-MS圖譜Fig.2 Total ion chromatogram of the secretions and the root extraction of C.indica by GC-MS

保留時(shí)間∕min化學(xué)物質(zhì)相對(duì)含量∕%相似度∕%4.142-羥基丙酸50.7187.814.34乙醇酸3.3688.41 4.55己酸1.2587.445.06呋喃二羧酸0.3376.075.11丙二酸0.4871.015.27β-羥基丁酸0.5380.986.761-羥基,2-烯戊酸0.2388.496.86琥珀酸0.5983.216.972,3-二羥基丙酸0.9095.207.21延胡索酸0.1483.097.912-羥基丁二酸1.4291.978.41蘋(píng)果酸0.8184.538.832,3,4-三羥基丁酸0.2178.298.953-甲氧基,4-羥基苯甲醛0.0983.239.80月桂酸0.2985.6410.11鄰苯二甲酸0.2493.7310.99十四烷酸0.1990.2311.74十五烷酸0.1585.5412.41棕櫚油酸1.1492.2612.57棕櫚酸23.2096.4513.19十七烷酸0.9185.2713.63油酸3.3287.2013.78硬脂酸5.2296.8215.93扁油酸1.1389.37

3 討論與結(jié)論

植物釋放的化感物質(zhì)通過(guò)抑制藻類(lèi)細(xì)胞酶活性、破壞藻類(lèi)的光合作用、破壞細(xì)胞膜等方式影響藻類(lèi)的正常生長(zhǎng)[19-20]。研究顯示[21-22]，通常情況下化感物質(zhì)濃度較高時(shí)會(huì)顯著抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，隨著其濃度的降低，該抑制作用會(huì)逐漸減弱、消失甚至轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)作用。本試驗(yàn)中的香根草種植水對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)具有一定抑制作用，可見(jiàn)香根草在蒸餾水中培養(yǎng)5d后其根系分泌的化感物質(zhì)就達(dá)到了較高濃度，因此抑制了銅綠微囊藻的正常生長(zhǎng)。葉綠素a是反映藻類(lèi)是否正常生長(zhǎng)和光合作用的重要指標(biāo)之一。研究顯示[23-25]，化感物質(zhì)通過(guò)降低藻類(lèi)葉綠素含量、抑制光合系統(tǒng)電子傳遞連活性等，減少藻類(lèi)同化產(chǎn)物的方式而抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)。與香根草種植水共培養(yǎng)21d后的銅綠微囊藻葉綠素含量降低，這可能是由于香根草種植水中化學(xué)物質(zhì)阻礙了銅綠微囊藻葉綠素a的合成或加速了葉綠素a的降解。經(jīng)NIST 譜庫(kù)比對(duì)，香根草種植水中有己酸、棕櫚酸、硬脂酸等物質(zhì)。Nakai等[26]從穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)中獲得了包括棕櫚酸、硬脂酸和油酸等多種脂肪酸，并證明這些脂肪酸對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，種植香根草5 d后，其水中就出現(xiàn)了可抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)的化感物質(zhì)，并且也以脂肪酸居多。研究結(jié)果表明[27-28]：己酸、棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸對(duì)銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和斜生柵藻有抑制作用。胡陳艷等[29]研究馬來(lái)眼子菜體內(nèi)脂肪酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)羊角月牙早的抑制作用時(shí)，也發(fā)現(xiàn)多種脂肪酸聯(lián)合作用具有協(xié)同抑藻效果。由此推測(cè)，可能是香根草根系釋放到水體中的脂肪酸共同作用抑制了銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。文媛等[30]將香根草根系浸提為凈油進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)香根草凈油成分主要為醇類(lèi)，酮類(lèi)、酸和萜烯類(lèi)化合物。本研究中香根草種植水中基本成分多為有機(jī)酸類(lèi)，這可能是由于試驗(yàn)中根系分泌物收集偏重有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)，也可能是由于香根草根系化合物在富營(yíng)養(yǎng)化水體環(huán)境下轉(zhuǎn)換形成新的化感物質(zhì)而抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)，具體理化機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)被廣泛應(yīng)用與藥物檢測(cè)、環(huán)境 分析、司法鑒定和未知樣品的測(cè)定，具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)[31]。本試驗(yàn)通過(guò)GC-MS技術(shù)初步測(cè)定了香根草種植水中可能有的化感物質(zhì)，但具體是哪些化合物對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生抑制作用，這些化學(xué)物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的抑制是否存在協(xié)同作用還有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香根草除了可以有效凈化水質(zhì)外，對(duì)于水華災(zāi)害中的優(yōu)勢(shì)藻種銅綠微囊藻具有極強(qiáng)的抑制作用。香根草對(duì)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化水體中的總氮，總磷具有明顯的去除效果[32]，能顯著改善富營(yíng)養(yǎng)化水體的水質(zhì)[33-35]。同時(shí)，香根草是集原料、飼料、燃料三料于一體的經(jīng)濟(jì)植物，是一種性能優(yōu)良的草類(lèi)資源[36]。因此，通過(guò)浮床種植香根草在改善生態(tài)環(huán)境的同時(shí)，又可產(chǎn)生商業(yè)價(jià)值，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

浮床植物香根草的存在可以持續(xù)抑制銅綠微囊藻的正常生長(zhǎng)。蒸餾水培養(yǎng)5 d獲得的香根草種植水與銅綠微囊藻共培養(yǎng)21 d后，對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)76%，對(duì)照培養(yǎng)液中銅綠微囊藻葉綠素a含量是香根草種植水中的8倍；蒸餾水培養(yǎng)5d后采集香根草種植水，經(jīng)GC-MS分析獲得己酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸等24種化合物，大多為有機(jī)酸類(lèi)。