TRPV1及其激動劑辣椒素在膀胱癌中的作用

余 潮，錢開宇

(1.東莞市道滘醫(yī)院泌尿外科，廣東 東莞 523176； 2.武漢大學中南醫(yī)院生物樣本庫，武漢 430071)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球男性腫瘤中位居第七位，在女性中位居第十七[1]；在中國男性腫瘤中居第六位，在女性中位排在十五位之后。我國的膀胱癌發(fā)病率雖然低于歐美發(fā)達國家，但近年來呈現上升趨勢[2]。目前,膀胱癌的病因不明，手術是最主要的治療方式。然而，非肌層浸潤性膀胱癌經尿道切除術后5年復發(fā)率為50%～70%，且有10%～25%的患者復發(fā)后進展為肌層浸潤性膀胱癌[3-4]。肌層浸潤性膀胱癌具有很強的侵襲性，需要采用根治性膀胱切除術治療，然而根治術后復發(fā)、轉移率仍接近50%[5]，5年生存率僅為50%～66%[6-7]。亟需探索更加有效的膀胱癌預防和治療方法。

辣椒素是辣椒屬植物中存在的一種天然物質，具有辛辣刺激味道，廣泛用于食品添加劑和鎮(zhèn)痛藥。研究人員通過體外實驗發(fā)現辣椒素對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用[8]，對辣椒素抗腫瘤作用的研究逐步受到重視。1997年，Caterina等[9]從大鼠的背根神經節(jié)中克隆出了一種辣椒素受體，并證明該受體在功能上是一種非選擇性離子通道；在結構上類似于瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)離子通道家族，因是最早被發(fā)現的香草酸受體，故命名為瞬時受體電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)[10]。TRPV1與多種腫瘤相關，但作用機制尚未完全明確。目前對于TRPV1和辣椒素對膀胱癌影響的研究報道較少，本研究對TRPV1及其激動劑辣椒素在膀胱癌中的作用進行綜述。

1 TRPV1

TRPV1蛋白由838個氨基酸組成，分子量為95 000，由6個跨膜蛋白(位于細胞膜上)和長度可變的N端和C端(位于細胞內)組成。其中第5和第6個跨膜蛋白之間的疏水基團內嵌，從而形成一個離子通過孔道[10-11]。最初報道TRPV1分布于背根神經節(jié)和三叉神經節(jié)[9]，現已發(fā)現在多種神經組織中均有分布，包括下丘腦、小腦、大腦皮質紋狀體、中腦等。在膀胱、肝臟等非神經組織中均能檢測到TRPV1的表達[12-13]。最新研究還發(fā)現，TRPV1不僅表達于細胞膜，在神經元、心肌細胞和許多癌細胞的內質網和線粒體上也均有表達[14]。

TRPV1具有兩大生理功能：傷害性刺激感受器和非選擇性離子通道。作為傷害性刺激感受器，TRPV1可被多種疼痛性刺激激活，包括溫度>43 ℃的傷害性熱刺激、pH<5.9的酸性環(huán)境以及香草酸類物質(辣椒素、樹膠脂毒素)等。作為一種非選擇性離子通道，TRPV1對二價離子的通透性大于一價離子，尤其對Ca2通透性高，具體為Ca2>Mg2+>Na+≈K+≈Cs+，對Ca2和Mg2+的通透性分別是Na+的10倍和5倍左右[9,15]。TRPV1通道因在調節(jié)細胞內Ca2水平中起作用，所以對細胞的多種生理活動具有重要調節(jié)功能。激活TRPV1通道后可以引起內質網、線粒體和細胞核Ca2水平增高，導致細胞受損，甚至介導細胞死亡，最終消除表達TRPV1的細胞[16-17]。

TRPV1的活性可由蛋白激酶A、蛋白激酶C、Ca2+/鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ等激酶通過磷酸化特定的殘基進行調節(jié)。Ser-116位點的磷酸化在蛋白激酶A介導的TRPV1脫敏調節(jié)中至關重要；Thr-144、Thr-370和Ser-502位點在蛋白激酶A介導的TRPV1的磷酸化/致敏化中發(fā)揮重要作用。蛋白激酶C主要作用于Ser-502和Ser-800位點，不僅增強辣椒素或質子誘發(fā)的反應，而且還降低溫度閾值，使得受體在生理條件下(37 ℃)具有活性。鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ主要作用于Ser-502和Thr-704位點，在辣椒素激活TRPV1中發(fā)揮重要作用。除磷酸化外，TRPV1的活性可以通過N-糖基化、氧化還原狀態(tài)等方式調節(jié)[18]。

TRPV1激動劑和拮抗劑分為外源性和內源性兩大類。外源性激動劑有：辣椒素、樹膠脂毒素、NGX-4010、zucapsaicin、大麻二酚等[10,19]。內源性激動劑有：大麻素、N-花生四烯乙醇胺、N-花生四烯酰多巴胺、N-油酰胺多巴胺等[19]。內源性拮抗劑為resolvin D2。外源性拮抗劑有：辣椒平、BCTC、iodo-resiniferatoxin、SB-366791、AMG-9810、A-425619、JNJ-17203212等[19]。各種研究中使用較多的外源性激動劑為辣椒素、樹膠脂毒素，使用較多的外源性拮抗劑為辣椒平。

2 TRPV1與膀胱癌

人體下尿路中密集分布著對辣椒素敏感的初級傳入神經元，這些神經元同時發(fā)揮疼痛感知的傳入功能和逼尿肌收縮的傳出功能，所以早期對TRPV1在膀胱內功能的研究多關注于治療疼痛性膀胱綜合征以及神經源性和非神經源性膀胱過度活動癥[20]。近年來隨著研究的深入，發(fā)現TRPV1除與疼痛相關外，還在乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌等腫瘤中發(fā)揮作用，甚至與腫瘤惡性程度和(或)預后相關[21-24]。以下詳述TRPV1在膀胱癌中的作用。

2.1 TRPV1在膀胱癌組織中的表達與分期分級相關 關于膀胱癌組織中TRPV1表達的變化最早由Lazzeri等[25]于2005年報道。研究者收集了13例正常膀胱組織、16例淺表性膀胱癌組織和12例肌層浸潤性膀胱癌組織進行研究，結果發(fā)現TRPV1在正常膀胱上皮中的表達高于在膀胱癌中，并且在膀胱癌中，癌細胞分化越差表達越低，腫瘤分期越高表達越低。研究者還采用免疫組織化學染色研究TRPV1在組織中的具體表達位置，發(fā)現在正常膀胱上皮中，TRPV1在淺表細胞的表達高于基底細胞和棒狀細胞；在淺表性膀胱癌中，TRPV1表達較正常膀胱上皮降低；在肌層浸潤性膀胱癌組織中，淺表細胞中偶爾檢測到散在的極低的TRPV1表達，在基底細胞和肌層浸潤性膀胱癌中則未檢測到TRPV1表達。蛋白質印跡實驗也證實，正常膀胱上皮中TRPV1蛋白表達量最高，淺表性膀胱癌稍低，肌層浸潤性膀胱癌中明顯降低，在T4期膀胱癌患者中檢測不到TRPV1蛋白表達。Kalogris等[26]進一步研究各種不同分期、分級的膀胱癌組織中TRPV1的表達，納入Ta期膀胱癌8例，T1期16例，T2期18例，T3期 12例，T4期8例，并以5例正常膀胱活檢組織為對照，研究結果顯示從腫瘤分期上看，從Ta和T1期(非肌層浸潤性膀胱癌)到T2、T3和T4期(肌層浸潤性膀胱癌)的組織中TRPV1的mRNA表達逐漸降低，在T3～T4期膀胱癌組織中的表達量僅為在正常組織中的1/10左右；從病理分級上看，TRPV1的mRNA 的表達隨著分級的增高逐漸減少，并且與腫瘤分期無關。研究者進一步采用免疫組織化學染色，也證實膀胱癌組織中TRPV1蛋白的表達也隨著腫瘤分期增加而顯著降低。更為重要的是，該研究還發(fā)現TRPV1表達下調的患者生存期顯著縮短，采用多因素Cox回歸分析進一步表明，TRPV1的表達可以作為膀胱癌預后的獨立危險因素，TRPV1表達減少是膀胱癌的獨立負性預后因子。

與以上研究者的觀點不同，曾有研究者認為，之前研究中檢測到的只是尿路上皮中的感覺神經纖維末梢，而尿路上皮本身不表達TRPV1[27]。針對這種質疑，Sterle等[28]對18例經尿道膀胱腫瘤電切的乳頭狀尿路上皮癌患者進行研究，采用蛋白質印跡實驗和免疫熒光染色以及掃描電子顯微鏡對正常尿路上皮、低級別和高級別膀胱尿路上皮癌中TRPV1的表達進行了研究。結果發(fā)現TRPV1不僅由傳入神經表達，在正常分化的尿路上皮中也有表達，與正常尿路上皮相比，低級別膀胱尿路上皮癌組織中TRPV1的表達下降，而高級別癌組織中進一步下降，證實TRPV1確實在尿路上皮中表達。

綜上，TRPV1在人體尿路上皮中表達，在高級別和(或)高分期的膀胱癌組織中逐漸降低，TRPV1表達下調是膀胱癌患者預后不良的獨立預測因子，膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與TRPV1表達的降低密切相關。

2.2 TRPV1在膀胱癌細胞系中的表達與惡性程度相關 細胞系是進行體外實驗研究的基礎，與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的重要基因在細胞系中通常有差異表達。常用的膀胱癌細胞系有5637、RT4、T24、UM-UC-3、J82、TCCSUP等，目前已有數位研究者對TRPV1在膀胱細胞系中的表達進行了研究。Amantini 等[29]采用熒光定量聚合酶鏈反應實驗及蛋白質印跡實驗均證實，TRPV1在高分化低級別的RT4細胞中高表達，但在低分化高級別的J82、EJ和TCCSUP細胞中表達明顯降低，提示TRPV1在細胞系中的表達隨著惡性程度增高而減少。進一步對5637 和RT4細胞的研究充分證明了TRPV1在膀胱癌細胞中的作用。相對于5637細胞，RT4細胞高表達TRPV1。RT4細胞經TRPV1激動劑辣椒素處理后活性明顯降低，但5637細胞經辣椒素(100 μmol/L)處理后反而活性增強，表現為促進血管生成(血管生成素1、血管生成素2和血管內皮生長因子表達上調)，促進侵襲和轉移能力增強(基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶9、顆粒酶A等上調)。為了探究以上RT4和5637細胞的表現不同是否由TRPV1導致，研究者將TRPV1的cDNA序列轉染至5637細胞，結果發(fā)現轉染后高表達TRPV1的5637細胞被辣椒素處理后顯示出細胞內Ca2+增加、生長抑制和凋亡，與辣椒素處理RT4細胞的效果相同。為了確認此結果，研究者進一步實驗發(fā)現，當加入TRPV1拮抗劑辣椒平后，辣椒素對轉染后高表達TRPV1的5637細胞的生長抑制作用消失[30]。以上實驗結果充分表明，辣椒素對膀胱癌細胞的抑制效果是通過TRPV1發(fā)揮作用的，正是由于TRPV1在不同膀胱癌細胞系的表達量不同，所以辣椒素處理后的結果也大不相同，甚至相反。鄭龍等[31]研究發(fā)現，TRPV1在膀胱癌RT4、5637、T24細胞中的表達也是隨著細胞惡性程度的增高而逐漸減少，辣椒素對這三種細胞的半抑制濃度(IC50)依次為 49.40 μmol/L、152.52 μmol/L、336.18 μmol/L，表明辣椒素對膀胱癌的生長抑制也是RT4細胞最敏感，5637細胞次之，T24最小，與國外研究者的報道相符[29]。

3 TRPV1與辣椒素

辣椒素是一種常用的TRPV1激動劑，由于天然存在于辣椒屬植物中而得名，其化學名稱為反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺，是人們感受到辣椒辛辣刺激味道的主要物質來源，可以引起從輕微發(fā)熱感至燒灼感的不同強度的感覺。辣椒素激活TRPV1后可以使疼痛傳入神經元釋放P物質，而持續(xù)激活則使P物質耗竭，最終使得疼痛不能感知和傳導，從而發(fā)揮止痛效果[8,10,30]?，F已證實8%辣椒素貼片對于手術創(chuàng)傷后疼痛、皰疹后神經痛、多發(fā)性神經病變和混合性疼痛綜合征安全有效[32]。除止痛作用外，辣椒素還有抗腫瘤作用，對胰腺癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、膽管癌等多種腫瘤均有抑制作用，但其作用機制尚不完全明確[33-34]。

需要特別注意的是，辣椒素雖然是TRPV1激動劑，但實際上辣椒素可通過多種機制發(fā)揮作用，并非都是依賴TRPV1介導的，所以不能混淆辣椒素和TRPV1的作用。在上述辣椒素(100 μmol/L)誘導5637細胞后侵襲性反而更強，研究者也指出高劑量(500 μmol/L)的辣椒素可以誘導細胞大量死亡，但細胞死亡是因為細胞毒作用，與TRPV1通道無關[30]。此外，研究發(fā)現，辣椒素在多種腫瘤中可以誘導活性氧生成，而發(fā)揮抗腫瘤作用，該作用不依賴TRPV1通道。Qian等[35]研究發(fā)現，辣椒素誘導活性氧升高，通過轉錄因子叉頭框蛋白O3a介導途徑抑制膀胱癌細胞增殖。Gonzales等[36]發(fā)現TRPV1表達于口腔鱗狀細胞癌中，使用辣椒素可以顯著抑制癌細胞活性，但使用辣椒平預處理并不能逆轉這種效果，并且單獨使用辣椒平也能抑制癌細胞活性。研究者由此推測辣椒素的作用機制并非激活TRPV1，進一步使用鈣成像技術等證實香草酸類物質的抗腫瘤作用是通過誘導活性氧生成和繼發(fā)的細胞凋亡，而不是依賴TRPV1激活實現的。此外，辣椒素還可以通過其他多種途徑抑制癌細胞。例如，Lau等[37]報道辣椒素可以誘導人小細胞肺癌細胞凋亡，但證實是通過TRPV6介導的，而不是通過TRPV1途徑。

綜上，辣椒素可以通過誘導活性氧升高、線粒體膜電位喪失促進細胞凋亡，引起周期阻滯，抑制癌細胞增殖等多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用，并非均需要激活TRPV1，所以必須對辣椒素的作用和TRPV1的作用予以區(qū)別。

4 辣椒素與膀胱癌

目前對于辣椒素在膀胱癌中的作用的研究報道并不多。辣椒素可以通過多種途徑抑制膀胱癌。Lin等[38]報道辣椒素可降低膀胱癌細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴性激酶4的表達水平，造成細胞周期阻滯，抑制膀胱癌增殖。該研究還發(fā)現辣椒素下調膀胱癌細胞中腫瘤相關的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的表達，從而促進細胞自發(fā)性凋亡，減少細胞遷移和上皮-間充質轉化，降低細胞遷移能力。Yang等[39]報道辣椒素以劑量依賴性方式降低膀胱癌T24細胞的活性，誘導活性氧產生和線粒體膜去極化，在濃度超過100 μmol/L以上時導致T24細胞死亡，但并未發(fā)生明顯的凋亡。進一步研究發(fā)現，辣椒素的上述作用可以被辣椒平逆轉，提示該效應可能是通過TRPV1介導的。Qian等[35]研究發(fā)現，辣椒素處理膀胱癌5637和T24細胞后引起細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴性激酶2、細胞周期蛋白依賴性激酶4、細胞周期蛋白依賴性激酶6水平下降，造成G0/G1細胞周期阻滯；上皮鈣黏素、β聯蛋白升高，神經鈣黏素水平下降，抑制膀胱癌細胞遷移。進一步研究發(fā)現辣椒素誘導活性氧升高，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶2和FOXO3a升高，可通過轉錄因子叉頭框蛋白O3a介導途徑抑制膀胱癌增殖。Yang和Qian的研究中均進行了免疫缺陷鼠皮下荷瘤實驗證實，辣椒素抑制體內膀胱癌細胞移植瘤的生長[35,39]。此外，Gilardini等[40]報道辣椒素可以通過CD91激活樹突狀細胞誘導膀胱癌細胞發(fā)生凋亡，而激活樹突狀細胞是獲得T細胞介導的持久有效的抗腫瘤免疫的關鍵。該研究提示，辣椒素是一種很有希望的抗膀胱腫瘤藥物，值得深入研究。

可見，辣椒素可導致活性氧增多，誘導膀胱癌細胞周期阻滯、增殖遷移能力下降，還可能通過激活免疫系統(tǒng)誘導膀胱癌細胞凋亡，最終對膀胱癌發(fā)揮抑制作用。

5 小 結

TRPV1作為一種非選擇性離子通道，可調節(jié)細胞內Ca2水平，對細胞功能具有重要調節(jié)作用。在膀胱癌細胞系中，TRPV1的表達隨著細胞系惡性程度增高而降低；在膀胱癌組織中，TRPV1表達隨著分期和(或)分級的增高而降低；在膀胱癌患者中，TRPV1表達下調的患者生存期顯著縮短，故TRPV1有望在膀胱癌診斷、治療和預后判斷中發(fā)揮作用。

辣椒素是TRPV1的天然激動劑，可以通過誘導活性氧升高，引起細胞周期阻滯，促進細胞凋亡以及激活抗腫瘤免疫等多種方式抑制癌細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。在研究過程中需要區(qū)分辣椒素的作用與TRPV1的作用。