檳榔堿提取及分析方法研究進(jìn)展

潘 虹

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099)

檳榔(Areca nut)為櫚科植物檳榔(Areca catechu L.)的干燥成熟果實(shí)，是繼煙草、酒精和咖啡因之后的世界四大嗜好品之一，特別流行于南亞和東南亞地區(qū)，如印度、馬來(lái)西亞，以及國(guó)內(nèi)的湖南、海南、臺(tái)灣等地區(qū)[1]，全世界有超過(guò)6億檳榔癖好者。盡管研究發(fā)現(xiàn)咀嚼檳榔具有抗寄生蟲、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化、抗菌以及抗高血壓等藥理作用[2]，但是也有文獻(xiàn)報(bào)道咀嚼檳榔與肝硬化、口腔黏膜下纖維化和其他毒理學(xué)效應(yīng)的發(fā)生具有密切關(guān)系[2]。國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)(The International Association of Research on Cancer, IARC)在2004年已將檳榔列為人類致癌物[3]。檳榔堿是檳榔中主要的生物堿類活性成分，也是主要的毒性成分[4]，因此在含檳榔制劑的質(zhì)量控制或食用檳榔后在生物基質(zhì)中準(zhǔn)確定性和定量分析檳榔堿都是非常必要的，是對(duì)檳榔進(jìn)行進(jìn)一步藥效和毒性研究的基礎(chǔ)。隨著分析技術(shù)的迅猛發(fā)展，從檳榔中提取檳榔堿的方法和測(cè)定檳榔堿含量的方法也日益增多。本研究主要介紹檳榔堿提取方法和測(cè)定檳榔堿含量的國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法，希望為檳榔的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

1 提取方法

1.1 加熱回流提取法

加熱回流提取法(heating reflux extraction)是使用水或乙醇等有機(jī)溶劑從天然植物中提取活性成分的傳統(tǒng)方法，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便和能耗低等優(yōu)點(diǎn)，但是需要消耗大量有機(jī)溶劑，且一般需6～8h才能提取完全，也不適合用于熱不穩(wěn)定化合物的提取。加熱回流提取法通常是通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取溶劑、提取時(shí)間、提取次數(shù)以及提取溫度，獲得目標(biāo)產(chǎn)物的最佳得率。羅士數(shù)等[5]通過(guò)加熱回流提取法萃取檳榔中的檳榔堿，以乙醇作為提取溶劑，以L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取溫度、次數(shù)、時(shí)間和料液比，結(jié)果當(dāng)提取溶劑是乙醇(85%，v/v)、提取溫度為85 ℃、料液比1∶14(g/mL)、提取次數(shù)3次，每次提取1 h時(shí)，檳榔堿的得率最高。另外，還將提取液堿化至pH=8，呈弱堿性的提取液一方面使得與檳榔中鞣酸結(jié)合的檳榔堿游離出來(lái)，同時(shí)避免了檳榔堿在強(qiáng)堿性條件下被水解，此時(shí)的檳榔堿得率為(0.251±0.03)%。

1.2 超聲波提取法

超聲波提取法(ultrasound assisted extraction, UAE)與傳統(tǒng)的加熱回流相比，儀器中的超聲波能夠增加提取液與提取溶劑的接觸面積，加快提取液中分子運(yùn)動(dòng)速率，并利用空化作用使細(xì)胞壁破裂[6]，從而提高了提取效率。羅士數(shù)等[7]運(yùn)用超聲輔助加熱回流提取法從檳榔中提取檳榔堿，與其同課題組優(yōu)化的傳統(tǒng)方法相比[5]，在40 kHz超聲波頻率和300 W超聲功率條件下，料液比減少42.8%，提取溫度從85 ℃下降至83 ℃，提取時(shí)間從1 h減少為20 min，而提取率基本能夠達(dá)到傳統(tǒng)方法的得率(0.1987%)，說(shuō)明超聲波提取法能夠在一定程度上提高提取效率，減少時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

1.3 亞臨界水提取法

亞臨界水提取法(subcritical water extraction, SCWE)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的綠色萃取方法。由于水在不同溫度和壓力下會(huì)呈現(xiàn)不同的極性，可以通過(guò)控制溫度和壓力人為改變其極性，使得天然植物中的水溶性或脂溶性活性成分被連續(xù)萃取出來(lái)[8]。由于在整個(gè)提取過(guò)程中都不使用酸、堿等催化劑或有機(jī)溶劑，因此此項(xiàng)技術(shù)既綠色環(huán)保又經(jīng)濟(jì)實(shí)用?？蝶惾绲萚9]采用SCWE法對(duì)檳榔中的檳榔堿進(jìn)行萃取，優(yōu)化出的最佳工藝為提取時(shí)間43 min，料液比35∶1，提取溫度144 ℃，結(jié)果表明在此條件下，檳榔堿的提取率為0.425%，高于超聲波提取法。

1.4 超臨界CO2流體萃取

超臨界CO2流體萃取(supercritical CO2extraction，SFE)與SCWE技術(shù)類似，都是通過(guò)改變超臨界流體CO2的壓力和溫度來(lái)改變其溶解能力，當(dāng)處于不同壓力和溫度條件下的超臨界CO2流體與混合成分中不同沸點(diǎn)、極性和分子量的物質(zhì)接觸時(shí)，就能夠選擇性地將其目標(biāo)成分萃取出來(lái)[10]，此方法在整個(gè)萃取過(guò)程不消耗有機(jī)溶劑，較為環(huán)保，特別適合于提高極復(fù)雜成分的萃取效率。張春江等[11]采用SFE法萃取檳榔中的檳榔堿，并優(yōu)化了萃取溫度、時(shí)間和壓力等條件，還在研究中添加了氨水作為堿化劑來(lái)使與酸性成分結(jié)合的檳榔堿游離出來(lái)，并使用了改進(jìn)劑(乙醇)來(lái)改善萃取效果，在72 ℃、57MPa下萃取26min，檳榔堿得率為(25.85±0.41)%。

2 分析方法

2.1 滴定法

滴定法(titration)是傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法，其基本原理是將標(biāo)定好的已知濃度的滴定液逐滴加入到未知濃度的溶液中，直到加入的滴定液的量與未知物化學(xué)反應(yīng)完全為止，根據(jù)所消耗的滴定液的體積和濃度，得出待測(cè)物的濃度。通常是利用添加在未知溶液中的指示劑或溶液本身的顏色變化來(lái)判斷滴定終點(diǎn)。劉蕊等[12,13]采用兩步滴定法測(cè)定檳榔堿的含量，即首先加入硫酸滴定劑，再加入氫氧化鈉滴定劑進(jìn)行滴定；劉蕊等通過(guò)滴定法考察了檳榔花果中檳榔堿含量隨著時(shí)間發(fā)生變化的過(guò)程，以及在檳榔果制備過(guò)程中，烘干溫度與時(shí)間對(duì)檳榔堿的含量影響。但是滴定法本身存在專屬性低、檢測(cè)限高和誤差大的缺點(diǎn)。

2.2 分光光度法

分光光度法(spectrophotometry)基本原理是測(cè)定待測(cè)物質(zhì)在某一個(gè)特定波長(zhǎng)處(或波長(zhǎng)范圍內(nèi))產(chǎn)生的吸光度，此吸光度在一定范圍內(nèi)與待測(cè)定物質(zhì)的濃度成正比。高敏等[14]采用可見光分光光度法測(cè)定檳榔中檳榔堿的含量，其原理是檳榔堿會(huì)和澳甲酚綠形成離子對(duì)，用氯仿萃取，最后再往氯仿層加入堿性溶液，嗅甲酚綠就會(huì)重新游離出來(lái)，再在可見光618 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，此方法最低定量下限為19.5 μg/mL。分光光度法操作簡(jiǎn)便，儀器比較常見，但是靈敏度較低，不能滿足檳榔堿的痕量分析。

2.3 色譜法

當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，待測(cè)混合物會(huì)在兩相之間進(jìn)行分配，利用不同成分的分配性質(zhì)不同，其遷移速度也就不同，最終達(dá)到分離的效果，此法稱為色譜法(chromatography)。目前，色譜法在醫(yī)藥學(xué)和化工領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，儀器普及度較高，操作越來(lái)越智能化，同時(shí)具有高靈敏度、高通量、用樣量少、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

2.3.1 薄層色譜掃描法 薄層色譜掃描法(thin layer chromatography, TCL)是將待測(cè)物及其對(duì)照品在薄層板上點(diǎn)樣，用流動(dòng)相展開后，對(duì)比它們的比移值，主要適用于化學(xué)成分的鑒別和雜質(zhì)檢查。2015版中國(guó)藥典一部中就采用了TLC法進(jìn)行檳榔藥材和飲片的鑒別[15]：采用硅膠G薄層板，展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-濃氨試液(7.5∶7.5∶0.2)，展開缸預(yù)先用氨蒸汽飽和，經(jīng)過(guò)展開后，取出薄層板，再放置在碘蒸氣中熏至斑點(diǎn)清晰。盧英翠和林勵(lì)等[16-17]還建立了TLC測(cè)定檳榔中檳榔堿含量的測(cè)定方法。

2.3.2 毛細(xì)管電泳法 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)是一類新型液相分離技術(shù)，已普遍應(yīng)用于醫(yī)藥分析中，其原理是以毛細(xì)管為分離通道，再加上高壓電場(chǎng)，是一種利用復(fù)雜樣品中各組分因遷移率不同而達(dá)到分離作用的分析方法[18]，具有靈敏度高、用樣量少的優(yōu)點(diǎn)。袁煒[19]建立了CE法測(cè)定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量，此方法不僅優(yōu)化出了合適的電解質(zhì)溶液(pH=3.2的25mmol/L磷酸-25mmol/L酸二氫鈉緩沖溶液)，成功使檳榔堿和檳榔次堿達(dá)到色譜分離，還優(yōu)化出了最佳分析條件：工作溫度29 ℃，電壓20 kV，虹吸進(jìn)樣20 s，檢測(cè)波長(zhǎng)為185 nm，最低定量下限均為2 μg/mL。也有國(guó)外文獻(xiàn)[20,21]報(bào)道了使用CE法測(cè)定檳榔堿的含量，此方法能夠在1 min之內(nèi)完成對(duì)檳榔堿的檢測(cè)，檳榔堿在20～1 500 μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

微流控芯片(Microfluidicchip)非接觸電導(dǎo)法是在CE基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，此法將樣品制備、分離和檢測(cè)等各項(xiàng)技術(shù)集成到一塊芯片上，實(shí)現(xiàn)了一體化技術(shù)平臺(tái)，被認(rèn)為是當(dāng)今分析方法的前沿技術(shù)之一。楊秀娟等[22]采用此方法測(cè)定檳榔飲片中的檳榔堿含量，采用的分析條件為：以2 mmol·L-1醋酸+2mmol·L-1醋酸鈉(pH=4.7)作為緩沖溶液，分離電壓2.5 kV，進(jìn)樣時(shí)間10 s，結(jié)果檳榔堿在10～200 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 高效液相色譜法 高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)主要用于多成分復(fù)雜混合物的分離和分析，80%左右的化合物都可以使用此方法進(jìn)行含量測(cè)定，應(yīng)用范圍十分廣泛，分離效率高。2015版中國(guó)藥典一部記載使用高效液相色譜法對(duì)檳榔進(jìn)行質(zhì)量控制，并以檳榔堿的含量作為質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的指標(biāo)[15]，方法是采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合硅膠色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-磷酸溶液(2→1000，pH值調(diào)至3.8)(55∶45)，在紫外波長(zhǎng)為215nm處檢測(cè)檳榔堿的含量?？滋m芬等[23]建立了超高效液相色譜法測(cè)定檳榔提取液中檳榔的含量，分析條件為：C18色譜柱，乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液(25∶20∶55)為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，最低定量下限為0.013 mg/mL。COX等[24]采用HPLC法測(cè)定人唾液中檳榔堿的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。陳浩桉等[25]采用陽(yáng)離子型(SCX)高效液相色譜柱，流動(dòng)相為乙睛一磷酸(氨調(diào)pH至3.8)(60∶40)，檳榔堿在0.05～0.30 mg/mL范圍成線性。除此之外，國(guó)內(nèi)外也有較多文獻(xiàn)[26-31]記載了使用HPLC法測(cè)定檳榔堿的含量。HPLC法與滴定法、分光光度法和薄層法等相比，靈敏度更高、精密度和重復(fù)性更好，已成為檳榔堿含量測(cè)定的最常用方法之一。但是由于檳榔堿結(jié)構(gòu)缺乏共軛基團(tuán)，紫外吸收較弱，所以此方法的靈敏度還有待提高。

2.3.4 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrography, LC/MS)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)和化工領(lǐng)域中最強(qiáng)有力的分析工具之一。筆者課題組就在前期研究中建立了LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中檳榔堿的濃度[32]，采用C18色譜柱，選擇甲醇-水(含0.1%甲酸)(5∶95)作為流動(dòng)相，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為156.2→53.2(檳榔堿)和256.1→152.1(內(nèi)標(biāo)更昔洛韋)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中檳榔堿在1～1 000ng/mL濃度范圍內(nèi)成線性，此方法大大提高了分析靈敏度；在研究中還發(fā)現(xiàn)檳榔堿由于含有羧酸酯鍵，在大鼠體內(nèi)會(huì)被高表達(dá)的羧酸酯酶水解生成檳榔次堿，造成了其體內(nèi)暴露量的低下。HU等[33]采用LC-MS法測(cè)定了人咀嚼檳榔后包括檳榔堿在內(nèi)的5個(gè)代謝物的含量。FENG等[34]采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定檳榔中檳榔堿等小分子化合物的含量。同時(shí)，也有較多國(guó)外文獻(xiàn)[35-40]報(bào)道了采用LC-MS法測(cè)定比格犬血漿、檳榔、人唾液、頭發(fā)、乳汁以及含檳榔中藥制劑中檳榔堿的含量。研究結(jié)果均表明采用LC-MS法測(cè)定檳榔堿的含量重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、專屬性好、靈敏度高，十分適合檳榔堿的痕量測(cè)定，特別適合于體內(nèi)檳榔堿的濃度測(cè)定。

3 結(jié)語(yǔ)

總的來(lái)說(shuō)，檳榔堿的幾種提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，建議實(shí)驗(yàn)者在有條件的情況下采用更加綠色環(huán)保安全的提取方法。就檳榔堿的分析方法而言，滴定法技術(shù)成熟，操作簡(jiǎn)單，成本較低，但是專屬性較差，且檳榔提取物中含有許多生物堿成分，會(huì)極大干擾檳榔堿的準(zhǔn)確測(cè)定，一般情況下，不建議使用該法；分光光度法、毛細(xì)管電泳法等也具有較為獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇；而高效液相色譜法作為2015版中國(guó)藥典收錄的對(duì)于檳榔藥材及其飲片含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法具有高效、靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)；而LC-MS法的靈敏度以及專屬性則比高效液相色譜法更高，已成為測(cè)定生物基質(zhì)或非生物基質(zhì)中檳榔堿含量的最強(qiáng)有力的分析方法。